蛛丝蛋白工程菌pNS2/BL21（DE3）发酵工艺和纯化方法的优化及表达产物的组织相容性研究

蜘蛛的拖丝是一种既具有抗张强度又具有高度弹性的奇特蛋白质纤维，作为生物材料具有广泛的应用前景，基因工程技术为大规模生产重组蛛丝蛋白提供了可能途径。本研究论文在本室前期工作的基础上，探讨了基因重组蛛丝蛋白工程菌pNS2／BL21(DE3)的高密度发酵工艺和重组蛛丝蛋白的纯化工艺，将所获得的重组蛛丝蛋白制得蛛丝蛋白支架材料，体外植入实验证实了蛛丝蛋白支架材料的生物相容性。 采用正交实验设计法，首次对蛛丝蛋白工程菌pNS2／BL21(DE3)高密度发酵条件进行了优化，蛛丝蛋白基因工程菌要获得较高表达水平的条件综合为：诱导pH7.0、温度32℃、0.1％(w／v)的Gly／Ala浓度和0.2mmol／LIPTG。重复验证实验表明：菌体最终OD值为55～60，目的蛋白占总蛋白的表达量为22～24％。 优化了蛛丝蛋白规模纯化方法，建立了重组蛛丝蛋白简单、高效的规模纯化工艺。优化的方案将加热温度提高而且延长加热时间，在除杂效果上大大优于原纯化方法。通过提高纯化效率和蛋白得率，最终纯化的重组蛛丝蛋白纯度可达85％以上，得率达10mg／g菌体，是原方法的3倍，而时间缩短了一半。 探讨了重组蛛丝蛋白材料的体内植入大鼠实验，比较了pNS2蛛丝蛋白、pNSR16蛛丝蛋白、PVA以及pNSR-Z蛋白四种材料的组织相容性，其优劣顺序为pNSR16＞pNS2＞PVA＞pNSR-Z。pNSR16和pNS2支架材料均显示出良好的组织相容性，其应用于组织工程的前景是广阔的。