目的:研究白头翁汤正丁醇提取物对白念珠菌毒力因子的影响。方法:用80%乙醇溶液采用回流法提取白头翁汤,再采用不同极性溶剂萃取白头翁汤乙醇总提取液,将提取物用旋转蒸发后得到结晶,检测抗白念珠菌活性,并选取效果最好的提取物进行下一步实验;采用XTT法、平板计数法检测白头翁汤正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction,BAEB)对白念珠菌在聚苯乙烯导管上的黏附率影响,水-烃两相法检测细胞表面疏水性(cell surface hydrophobicity,CSH)的变化;振荡法检测BAEB对白念珠菌絮凝能力的影响,并通过扫描电镜观察黏附的白念珠菌形态;倒置显微镜下观察不同p H条件对白念珠菌菌丝形成的影响,并选择菌丝形成最佳的p H条件;荧光显微镜观察BAEB干预白念珠菌菌丝的发育及对菌丝活力的影响,固体培养基上观察菌落形态变化,半固体培养基上观察BAEB对白念珠菌菌丝侵袭能力的影响,扫描电镜观察BAEB对白念珠菌在聚苯乙烯导管上菌丝形态的影响;XTT法检测BAEB对白念珠菌标准株及外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)临床株生物膜形成的抑制能力(SMIC80),time-kill法检测BAEB对白念珠菌活菌数的动态影响,结晶紫染色法检测BAEB对白念珠菌生物量(Biomass)的影响,扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)观察BAEB对白念珠菌生物膜形态结构的影响;激光共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)检测BAEB对白念珠菌生物膜荧光信号强度的影响,采用XTT减低法及称重法检测BAEB对白念珠菌成熟生物膜分散的影响,q RT-PCR检测了白念珠菌不同生长阶段的16个白念珠菌毒力相关基因;动物实验观察BAEB对小鼠外阴阴道念珠菌病模型的治疗作用。结果:(1)提取物抗菌活性检测发现白头翁汤正丁醇提取物(Butyl alcohol extract of Bai Tou Weng decoction,BAEB)MIC为64～256μg/m L,效果优于其他提取物。(2)黏附实验结果发现512、1024μg/m L BAEB可显著抑制黏附2h、4h时的白念珠菌的CFU及代谢活性。(3)BAEB能够降低白念珠菌细胞表面疏水性(CSH),使其无法有效的黏附于宿主细胞及无机植入物的表面,同时也能够降低其絮凝能力,影响白念珠菌细胞-细胞之间的黏附能力。(4)形态转化实验结果当p H为8.0时,白念珠菌菌丝形成能力最好,512、1024μg/m L BAEB可显著抑制白念珠菌菌丝的发育,荧光显微镜、扫描电镜及固体、半固体培养基上的菌落进一步证实了BAEB干预后形态学的改变。(5)BAEB对白念珠菌SMIC80为1024μg/m L,经过512、1024μg/m LBAEB干预后,白念珠菌生物膜生物量明显减少,通过扫描电镜观察,BAEB可以抑制白念珠菌生物膜的形成,使其无法形成完整的生物膜,生物膜分散实验发现BAEB对分散无明显影响。(6)q RT-PCR检测了白念珠菌不同生长阶段的16个与其毒力因子相关基因,BAEB干预后除少数基因表达无明显变化,大多都发生倍数不同的上调或下调,且呈剂量依赖性。(7)体内实验发现BAEB可有效降低外阴阴道念珠菌病小鼠阴道内白念珠菌的真菌载荷数,经过涂片实验发现BAEB可以抑制白念珠菌在小鼠阴道内菌丝形态的转换;此外,对于白念珠菌引起的阴道粘膜感染,BAEB可改善炎症。结论:BAEB对白念珠菌的黏附能力、形态转化及生物膜形成等毒力因子具有较强的抑制作用,能够降低菌体入侵宿主的能力,减弱其致病性,从而达到治疗目的。
