电纺构建pNSR16/Gt-PU双层小直径血管支架及性能的初步研究

血管疾病已成为威胁人类健康的一大杀手,通常应用血管移植手术进行治疗。自体血管和人工血管是主要的移植物。虽然自体血管的生物相容性良好,没有免疫排斥反应,但是来源有限。人工血管在大直径血管损伤修复中已取得良好的效果,但在小直径血管移植中易出现内膜增生、血栓形成等问题,无法满足临床的要求。因此,小直径血管成为血管组织工程领域研究的热点。 聚氨酯(PU)的相分离结构赋予其良好的机械性能和一定的生物相容性,常被用作生物医学材料。明胶(Gt)与细胞外基质中的胶原有着类似的结构,由胶原温和断裂形成,富含亲水性氨基酸基团,在组织工程领域应用也十分广泛。蛛丝蛋白凭借良好的生物相容性和可降解性,在组织工程领域备受关注。本实验室自制的蛛丝蛋白命名为pNSR16,并对PNSR16/Gt的电纺参数及其性能进行研究,结果表明该支架具有良好的生物相容性,但是力学性能较差。在此基础上,利用静电纺丝技术制备内层为PNSR16/Gt复合纤维,外层为PU纤维的双层管状支架,研究支架的理化性能和生物学性能。研究结果如下： 一、改进静电纺丝仪,制备双层小直径血管支架。对静电纺丝仪的电压加载位置和旋转接收装置进行改进,改进后大大降低了纺丝电压,提高了操作安全性。以甲酸作为明胶和蛛丝蛋白的共同溶剂、二甲基甲酰胺和丙酮混合溶剂作为聚氨酯的优良溶剂,应用静电纺丝技术制备内层为pNSR16/Gt,外层为PU的双层管状支架。并对PU的电纺参数进行考察,研究结果表明,PU静电纺丝的最佳纺丝参数为：VDME:VACE=1:1,纺丝液浓度5%(w/v),电压18kV,接收距离20cm,挤出速度0.5mL/h。 二、考察小直径血管支架的理化性能。吸水性实验结果证实明胶的加入明显改善了单纯聚氨酯支架的吸水性。双层血管支架的孔隙率为88.7+1.5%,能够满足细胞渗透生长的要求。力学测试结果表明,复合支架具有较低的渗透性(6.8+0.2mL/(min·cm-2)),爆破强度为276+7.1KPa,缝合强度为4.9+0.8N,符合临床上不小于2N的要求。断裂应力24.6+3.6MPa、断裂应变145+3.8%,均优于天然血管和商业化的ePTFE人造血管。双层血管支架在PBS中的降解速率显著慢于多酶体系中的降解速率。 三、探讨外层PU支架的血液相容性。溶血实验、复钙化凝血时间测试、动态凝血时间实验和血小板粘附实验结果均表明聚氨酯具有良好的血液相容性。具体结果如下：溶血率1.22%,符合ISO中小于5%的要求。复钙化凝血时间为379s,动态凝血历时较长,曲线呈缓慢倾斜趋势。扫描电镜结果显示支架材料对血小板的粘附较少,粘附的血小板形态未发生明显变化,呈无伪足的圆盘状。 四、为后续细胞相容性实验制备种子细胞——分离血管内皮细胞。利用组织块贴壁法成功获得血管细胞,倒置相差显微镜下观察,细胞呈多角形或梭形,为贴壁细胞的典型形态。细胞免疫荧光法检测内皮细胞标志物-vWF,结果显示细胞浆呈绿色荧光,DAPI复染后细胞核呈蓝色荧光,属于阳性表达,证实分离的血管细胞为内皮细胞。 五、研究小直径血管支架的细胞相容性。体外细胞毒性实验证实血管支架的性能稳定,常温下对细胞无毒性,毒级为0-1级。SD大鼠胸主动脉内皮细胞在单纯PU和双层血管支架上均能粘附、增殖,维持自身形态和功能。添加RGD-蛛丝蛋白和明胶的双层血管支架较单纯PU血管支架更有利于细胞的增殖。