鲍曼不动杆菌替加环素耐药机制与中药单体对替加环素耐药菌的抗菌作用研究

目的了解鲍曼不动杆菌临床分离株对替加环素的耐药情况,探讨鲍曼不动杆菌中8种RND外排泵基因的分布与表达同替加环素耐药表型之间的关系。比较5种中药单体对替加环素耐药鲍曼不动杆菌的体外抗菌活性,分析替加环素与中药单体联合用药的增敏作用及相关作用机制。为临床有效预防和控制耐药菌的感染和播散提供实验室依据,同时为寻找新的治疗方案提供线索。方法采用16S-RNA和rpo B多重PCR方法鉴定分离株的菌种。采用微量肉汤稀释法检测120株鲍曼不动杆菌对替加环素的最低抑菌浓度（minmal inhibitory concentraton,MIC）,分为替加环素耐药鲍曼不动杆菌（tigecycline-resistant Acinetobacter baumannii,TRAB）和替加环素敏感鲍曼不动杆菌（tigecycline-susceptible Acinetobacter baumannii,TSAB）。1.采用琼脂二倍稀释法测定TRAB对18种抗菌药物的最低抑菌浓度。2.应用多位点序列分型（MLST）技术了解TRAB的分子流行病学情况。3.应用PCR技术扩增120株鲍曼不动杆菌的8种RND外排泵基因及调控基因（ade ABC-ade RS、ade FGH-ade L、ade IJK-ade N、ACICU-02904、ACICU-00143、ACICU-03412、ACICU-03066、ACICU-03646）。4.应用实时荧光定量（real-time）PCR分析外排泵基因（ade B、ade J、ade G、ACICU00143、ACICU03066、ACICU03646）的表达量。5.采用微量肉汤稀释法测定5种中药单体（白花丹醌、葫芦素B、柴胡皂苷d、盐酸小檗碱、棓丙酯）对TRAB的体外抑菌活性。6.采用微量肉汤棋盘稀释法测定TRAB对替加环素联合白花丹醌的MIC值,计算部分抑菌浓度指数值（fractional inhibitory concentration index,FICI）。7.选取5种外排泵抑制剂羰基氰化物间氯苯腙（carbonyl cyanide 3-chlorophenylh ydrazone,CCCP）、苯丙氨酸-精氨酸-β-苯胺（phenyl-arginine-β-naphthylamid e,PAβN）、N-甲基吡咯烷酮(1-（1-naphthylmethyl）-Piperazine,NMP)、维拉帕米和利血平对TRAB进行外排泵抑制试验,与白花丹醌对TRAB的外排泵抑制效果进行对比。结果1.替加环素对120株鲍曼不动杆菌的MIC分布范围:<0.0625～8μg/ml,其中8株为TRAB,耐药率为6.7%;112株为TSAB。2.8株TRAB对18种抗菌药物普遍耐药,对氨基糖苷类、四环素类药物的耐药情况严重。3.8株TRAB中5株为ST-195型,剩余3株分别为ST-837型、ST-92型及ST-908型,8株均属于鲍曼不动杆菌全球最大的流行克隆CC92复合体。4.8株TRAB中均检测到6种外排泵基因及调控基因（ade ABC-ade RS、ade FGH-ade L、ade IJK-ade N、ACICU00143、ACICU03066和ACICU03646）。112株TSAB中ade ABC-ade RS、ade FGH-ade L和ade IJK-ade N外排基因检测率为38.4%,新近发现的ACICU00143、ACICU03066和ACICU03646外排泵基因检测率为50.9%。5.替加环素耐药组比敏感组的ade B、ade G、ACICU03066、ACICU03646平均表达量分别提高了23.5倍、3.75倍、1.7倍、1.44倍,其中两组的ade B表达量的差异有统计学意义（p=0.014）。6.5种中药单体中白花丹醌对TRAB的抑菌活性最强,MIC值范围为16～32μg/ml。7.白花丹醌和替加环素联合用药时,TRAB的MIC值比单独用药时有所下降,经棋盘法计算FICI,其中75%具有相加作用;25%为无关作用。8.以替加环素为底物,加入外排泵抑制剂CCCP、PAβN、维拉帕米,TRAB中外排泵阳性菌株分别为4株（50%）、3株（37.5%）、1株（12.5%）;加入NMP和利血平后,TRAB替加环素的MIC值均未下降。加入白花丹醌后阳性菌为4株（50%）。结论1.8株TRAB同时携带6种RND外排泵基因（ade ABC、ade FGH、ade IJK、ACICU00143、ACICU03066和ACICU03646）。2.鲍曼不动杆菌中ade B表达量伴随菌株对替加环素MIC值增加而升高,RND家族中ade B表达量上调导致Ade ABC活性增加是替加环素耐药的一个重要机制。3.在体外环境下,白花丹醌对替加环素耐药鲍曼不动杆菌具有一定抑菌活性;白花丹醌与替加环素联合用药可增加TRAB对替加环素的敏感性,且部分具有相加作用,其抗菌增敏机制可能与外排泵抑制相关。