目的:研究长期给予小鼠不同剂量的齐墩果酸,其体内药物浓度的变化与肝毒性的关系及对Nrf2等信号通路基因的影响。方法:将40只健康SPF级雄性昆明小鼠随机分为4组:正常对照组,低剂量组(45.7mg/kg),中剂量组(91 mg/kg),高剂量组(137 mg/kg),每组10只,连续给药90天,末次给药后1小时,收集动物的血液和肝脏,测定血浆ALT、AKP活性及TBIL含量;HE染色、Masson染色、天狼星红染色观察齐墩果酸对肝脏形态学的影响;LC-MS法检测血浆和肝脏中齐墩果酸的浓度;RT-PCR法检测齐墩果酸对小鼠肝脏TGFβ/Smad通路、Hedgehog通路、胆汁酸合成通路以及Nrf2通路基因mRNA表达的影响;Western-blot法检测肝细胞核内Nrf2蛋白表达。结果:1.给予小鼠小剂量齐墩果酸90天,与正常对照组比较,小鼠体重无明显变化,肝重指数增加,丙氨酸转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)活性升高,但总胆红素(TBIL)含量不变,在肝脏HE染色中,正常对照组肝小叶结构清晰完好,齐墩果酸低剂量组出现肝肝细胞轻微肿大,中剂量组出现肝细胞点状坏死,高剂量肝细胞点状坏死面积增多;Masson染色观察到正常对照组汇管区周围被染成蓝色的胶原纤维含量正常,低剂量组汇管区,被染成蓝色的面积扩大,中剂量组汇管区内成纤维细胞增生,胶原纤维间隔形成,高剂量组汇管区内成纤维细胞大量增生,成纤维隔,纤维间隔伴小叶结构紊乱;天狼星红染色观察到正常对照组汇管区周围被染成红色的纤维细胞含量正常,随给药剂量的增加,被染成红色的纤维细胞面积增大,高剂量时可观察到肝细胞出现大面积纤维化。2.LC-MS法检测到齐墩果酸在血浆中的药物浓度随给药剂量的增加而增加,而肝脏中的齐墩果酸浓度基本相同,且与给药剂量无关。3.长期给予齐墩果酸对小鼠TGFβ/Smad通路中Smad7 mRNA的表达具有明显的抑制作用(P<0.05);低剂量和中剂量可诱导Smad 3的表达(P<0.05);抑制Hedeghog通路中的Shh、Smo mRNA基因的表达(P<0.05);可抑制胆汁酸合成通路中Cyp27a1和SHP的mRNA表达(P<0.05),低剂量对Nrf2通路中Nrf2、GCLC、NQO1、GST、HO-1、Mrp2以及Mrp3的mRNA表达具有诱导作用(P<0.05)。4.Western-blot法检测肝细胞核内Nrf2蛋白在高剂量组中表达明显升高(P<0.05)。结论:长期给予小鼠小剂量齐墩果酸会导致肝纤维化的发生,肝纤维化的程度与血药浓度呈正比,产生肝纤维化的原因与Nrf2有关。
