栀子(Gardenia jasminoides Ellis)味苦、性寒,入心、肝、胃、三焦经,有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒,外用消肿止痛的功效;用于治疗热病心烦,湿热黄疸,淋证涩痛,血热吐,目赤肿痛,火毒疮疡;外治扭挫伤痛。也是临床十分常用的保肝利胆药,栀子果实中所含的环烯醚萜苷类的主要成分是栀子苷,栀子苷是栀子的主要有效成分,是现行药典中列出的栀子含量检测指标。动物实验的研究报道证实大剂量的栀子单药水煎液或栀子苷可能对动物有一定的肝、肾毒性,报道研究仍以肝脏毒性为主,关于肾脏毒性的报道鲜少,且未见相关机制的研究。目的:研究栀子苷短期给药和长期给药对大鼠的潜在肾脏毒性,初步探讨引起肾脏潜在毒性的剂量和毒性机制,为临床用药提供相关的安全性信息。方法:分别进行给药3天和给药90天的肾脏毒性实验,动物分组和给药方法为:(1)短期给药的肾毒性实验:采用SD大鼠,随机分为4个组,包括对照组,栀子苷50、100、300 mg·kg-1组(根据栀子中栀子苷含量推算,约相当于临床栀子剂量的5、10、30倍)。栀子苷各剂量组灌胃给药,每日1次,连续给药3天;对照组灌胃给予同体积纯净水。(2)长期给药的肾毒性实验:采用SD大鼠,随机分为6个组,包括对照组,栀子苷25、50、100 mg·kg-1组(根据栀子中栀子苷含量推算,约相当于临床栀子剂量的2.5、5、10倍),栀子提取物组和栀子豉汤组(剂量相当于栀子苷50mg·kg-1)。各给药组均灌胃给药,每日1次,连续给药90天。短期给药实验于第3天末次给药结束后、长期给药实验于给药90天给药结束后分别进行样本收集和各项检测指标观察。于各时间点给药结束后,将动物单只放入代谢笼,收集16h尿液,检测尿液相关的定性指标和肾损伤因子-1(Kim-1)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)含量。尿液收集完毕后,将动物麻醉,从腹主动脉取血,检测血液尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)的含量。摘取肾脏,一侧肾脏进行病理学检查;另一侧肾脏组织匀浆,提取总RNA,采用q PCR方法检测Oat1、Oat3、Nga L、Timp-1、Clusterin的m RNA表达,采用Western-Blot方法检测Oat1、Oat3的蛋白表达。90天实验的肾脏还增加肾脏TGF-β1和p38-MAPK m RNA表达以及TGF-β1、p38-MAPK蛋白表达。结果:(1)短期给药的肾脏毒性:栀子苷高剂量(300mg·kg-1)给药3天后对大鼠肾脏有一定毒性,病理检查可见肾小管细胞肿胀,有空泡化改变,肾小管腔内见粉红色渗液和少量细胞脱落;尿液Kim-1和Nga L水平显著增高;但血液生化指标BUN、CRE未见明显变化。但降低剂量(50、100mg·kg-1)给药3天,上述各指标未见明显异常。说明栀子苷剂量过大时(300 mg·kg-1)短期给药,可造成大鼠潜在的肾脏毒性,而控制剂量在≤100 mg·kg-1时,短期给药则毒性不明显。(2)长期给药的肾脏毒性:栀子苷100mg·kg-1剂量组给药90天后,可见肾脏颜色变深呈墨绿色;25、50mg·kg-1剂量组颜色变化不明显。100mg·kg-1剂量组可见肾小管细胞胞浆内有药物色素沉积,部分动物细胞轻度肿胀,管腔内少量渗出物,显示有一定毒性改变,但程度很轻;25、50mg·kg-1剂量组病理损伤不明显。雌性动物100mg·kg-1剂量组尿液NGAL明显上升,雄性未见明显增高。各剂量组血液BUN、CRE、Kim-1和NGAL水平均与对照组比较无显著差异。栀子提取物组和栀子豉汤组仅有个别动物的肾小管有轻度肿胀和药物色素沉积,其他动物未见明显病理变化,血液BUN、CRE和尿液Kim-1和NGAL水平均与对照组比较无显著差异,提示无明显毒性病理损伤。(3)对肾脏转运蛋白及其他相关分子表达的影响:栀子苷给药3天时,50、100、300mg·kg-1剂量组均可下调Oat1和Oat3的m RNA和蛋白表达,上调NGAL、Timp-1、Clusterin m RNA表达,结果均有统计学意义。长期给药90天时,栀子苷50、100 mg·kg-1剂量组以及栀子提取物、及栀子豉汤组对肾脏组织中的Oat1和Oat3表达有下调趋势。结论:(1)栀子苷短期用药剂量过高时(300mg·kg-1,约相当于临床剂量30倍)可造成大鼠肾脏毒性,100 mg·kg-1及以下剂量水平短期用药无明显毒性。传统的肾脏功能指标血液BUN和CRE无明显变化,但尿液Kim-1和NGAL水平增高,建议增加尿液Kim-1和NGAL含量检测作为毒性监测指标。(2)栀子苷剂量达到100 mg·kg-1时(约为临床剂量的10倍)时用药90天可造成肾小管细胞轻度病变,显示有一定的肾脏毒性,但程度很轻。25、50 mg·kg-1未见肾脏毒性。(3)栀子苷的肾脏毒性与其对肾小管细胞转运体的抑制有一定关系,在短期用药较高剂量(300 mg·kg-1)时即可明显抑制肾脏Oat1和Oat3的表达,这可能影响肾脏的毒性物质的排泄,从而造成毒性。长期用药时,可增加肾脏基质金属蛋白酶抑制因子Timp-1的表达,这可能在一定程度上影响了细胞外基质的合成与降解,从而对肾脏造成一定的影响。(4)栀子提取物和栀子豉汤在本研究所涉及的剂量下给药90天对大鼠无明显的毒性作用。
