大葱胞质育性位点和核恢复基因的分子标记及其辅助育种

大葱细胞质雄性不育在杂种优势利用中具有重要价值，分子标记辅助育种可提高育种效率，加快其不育系、保持系选育步伐。本研究以大葱不育系209A、保持系209B、章丘大葱、隆尧大葱、莱芜鸡腿葱、大宫黑、韩国大葱等为试材，获得了与胞质位点、核恢复基因连锁的标记，探索了辅助育种的可行性，具体结果如下： 1．胞质育性位点标记 利用220个随机引物对不育系、保持系叶绿体DNA（cpDNA）、线粒体DNA（mtDNA）进行了RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）分析，获得了5个与胞质育性位点连锁的标记，分别是S132800、S38960、S72300、S731100、S2002400。其中S132800、S38960、S731100、S2002400是与不育位点连锁的标记，而72300是与可育位点连锁的。在120个单株中，S132800、S72300、S2002400重组率为0，S38960、S731100重组率分别为7.5％、4.2％。S132800能区分章丘大葱、莱芜鸡腿葱、韩国大葱、天津五叶齐等品种的N（Normal）、S（Sterile）胞质；S38960、S72300、S731100只能区分章丘大葱、天津五叶齐等品种的N、S胞质；S2002400能区分所有供试品种的N、S胞质，因而具有更大的利用价值，这一结果反映了基因型对标记的影响。利用S132800、S2002400分析了209A与209B、不同品种的测交、杂交后代以及209B的自交后代，结果表明筛选的标记能稳定遗传，可在辅助育种中应用。 将特异片段S132800、S2002400从凝胶中回收、纯化，连接pGEM—T—easy载体，筛选克隆进行了测序分析。根据测序结果，设计了两对SCAR（Sequence-characterized Amplified Region）引物，SCS13、SCS200。其中SCS13能成功地区分N、S胞质，适宜退火温度为59℃。而S2002400转化为SCAR后多态性消失。SCAR产物加入EB直接检测存在一定的误差，但200v电压10—20min电泳可以快速、准确地鉴定单株基因型。利用SCS13、S2002400分析了章丘大葱、隆尧大葱、莱芜鸡腿葱、韩国大葱、大宫黑品种中N、S胞质的比例，提出了利用育性位点标记辅助选育不育系和保持系的程序。利用胞质位点标记可预测不同品种选育不育系和保持系所需的基础群体数。与常规方法育种方法相比，标记辅助育种在章丘大葱中应用可减少杂交组合数和自交株数80％，在莱芜鸡腿葱中减少72.2％，大宫黑中减少39.4％，隆尧大葱和韩国大葱中减少20％。另外，结合表型选择的标记辅助育种可减少1—2个选择世代周期，降低成本，提高育种效率。 利用回收纯化的S132800片段经放射性标记作为探针，对不育系和保持系的mtDNA进行了Southern杂交，两系之间表现出了多态性。 盖树鹏：大葱胞质盲性泣点和核恢复基因的分子标记及其辅助育种 二．恢复基因标记 根据不育系209A、不同群体不育株与可育株24对杂交组合后代的分离情况， 提出了胞质一两对主基因微效多基因互作的遗传假设。基于这一假设，在无现成恢 复系，基因型未知情况下建立了恢复基因标记方法。利用不育；可育分离比为1：3 的群体构建了两对不育、可育混合基因池，获得了与恢复基因MS；连锁的标记 SZ15。、569。、5856I8、5102248，，与恢复基因 MSZ连锁的标记 53271061，其重组率 分别为14．9％、12．6％、9．2％、8．09／6、6．7％。选择重组率较低的待异片段克隆到 PGEM—T—easy载体，进行了测序，并根据序列设计了3对SCAR引物，其中585。；s 转化为SCAR标记后多态性消失，SCR327结合SCR1022能区分章三大葱、隆尧大 葱、日本3号、莱芜鸡腿葱等品种的核基回型。 同时建立了大葱AFLP分析、银染检测的技术体系，揭示了两基回池之间的差 异，但其与恢复基因的连锁关系尚需进一步鉴定。 在上述工作基础上，分析了恢复基因辅助育种可行性，建立了恢复基因标记辅 助选育不育系、保持系的程序。 3．两种标记的辅助育种比较、应用 与胞质育性位点标记相比，核恢复基冈标记辅助育种可进一步减少杂交组合和 自交株数，缩短育种周期，而且总DNA提取更容易，因而具有更好的应用前景。 实践中亡将两者结合使用，首先利用胞质育性位点标记确定育种的基础群体，然后 挑选性状忧良的单株，利用恢复基因标记鉴定基因型，选择基因型为ms；ms；ms。ms； 的村料用丁不育系和保持系的选育。这样可将育种群体降低至20株以内，也能保 证在3—4代内选出育性稳定的不育系和保持系，降低了工作量，提高了育种效率。 在隆尧大葱中，可降低工作量 92．4 gfo。另外还讨论了环境条件，标记方法，基因型， 连锁距禹对质量性状基因标记和辅助育种的影响，分析了MAS的应用前景。