利塞膦酸钠抑制骨髓间充质干细胞成脂分化并通过逆转RANKL/OPG的表达抑制破骨细胞分化

背景：骨质疏松症是以骨量减少,骨微结构破坏为特点,并导致骨脆性增加及易引起骨折的一类疾病。骨质疏松症波及全球约200,000,000人口,给家庭及社会带来了严重的经济负担。国际骨质疏松基金会(IOF)的资料显示,34%的绝经后妇女及20%的老年男性罹患此病。骨质疏松症所致的骨折及其严重并发症导致死亡率正逐年上升。 骨质疏松症及老年性骨量减少,在骨量减少的同时通常伴随着骨髓内脂肪组织的增多。实际上,骨髓内脂肪的异常增多在所有骨丢失性疾病上均有体现,如去势后骨质疏松、废用性骨质疏松及糖皮质激素引发的骨质疏松。如今,脂肪组织的功能已不再被认为是单纯的能量储存及空间填充作用,它可以作为内分泌器官,分泌各种细胞因子及激素,参与骨代谢活动。骨髓内的脂肪细胞有望成为骨质疏松症诊断、预防及治疗的新靶点。 骨组织的稳态主要取决于骨吸收及骨形成的相互平衡。起骨吸收作用的主要细胞是破骨细胞。破骨细胞主要来源于单核巨噬细胞系统,由单核细胞融合分化而成。其分化和成熟依赖于巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、护骨素(OPG)及护骨素配体(RANKL)。OPG及RANKL主要来源于成骨细胞、基质细胞,对骨重建起着重要的作用。RANKL通过与表达于破骨细胞的细胞核因子-KB受体活化因子(RANK)结合,能够刺激破骨细胞活化和增殖；OPG与RANK竞争结合RANKL,从而抑制骨吸收,防止骨质疏松的发生。RANKL/RANK/OPG轴的失衡是导致很多溶骨性骨异常吸收疾病的主要原因。 利塞膦酸钠(RIS),是第三代双膦酸盐的代表,系含氮双膦酸盐,具有显著的抗骨吸收作用,临床疗效好,安全性高,被广泛应用于抗骨质疏松的治疗。既往对抗骨质疏松药物的研究往往局限于破骨细胞和成骨细胞本身,其对骨髓内含量最丰富的脂肪组织的影响及机制的研究尚未明确。 目的：本文通过细胞试验,探讨了利塞膦酸钠对人骨髓间充质干细胞成脂分化过程中产生的RANKL/OPG的变化,及对破骨细胞的影响,为阐明利塞膦酸钠防治骨质疏松症的机制提供新的理论依据。 方法：本研究旨在通过分子、细胞探讨利塞膦酸钠抑制脂肪细胞分化,并通过OPG/RANKL/RANK系统调节破骨细胞的生成。用RT-PCR, ELISA和Western blotting等生物学技术,从基因及蛋白表达水平,研究利塞膦酸钠对人骨髓间充质干细胞成脂分化的影响,及其表达的RANKL/OPG的情况,研究其相应的分子生物学基础,并对其相关的分子作用机制进行初步探讨。 结果： 1、骨髓间充质干细胞具有体外成脂、成骨双向诱导分化能力 骨髓间充质干细胞作为多能干细胞的成脂、成骨双向分化能力的证实。骨髓间充质干细胞成脂诱导2周后,胞浆内大量脂滴形成。PPARy特异性表达。骨髓间充质干细胞成骨诱导3周后,经茜素红染色可见细胞表面及胞浆内大量钙结节形成。 2、利塞膦酸钠浓度依赖性抑制骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化 利塞膦酸钠呈浓度依赖性抑制人骨髓间充质干细胞成脂分化。不同浓度的利塞膦酸钠(1～25μmol/L)作用于成脂诱导的骨髓间充质干细胞,成脂率(ADpencent)呈浓度依赖性下降(P<0.05)。 3、人骨髓间充质干细胞成脂分化时RANKL/OPG表达上调 骨髓间充质干细胞成脂诱导分化2周。Westen Blot结果显示：RANKL蛋白表达显著升高,OPG蛋白表达无显著变化,RANKL/OPG显著升高(P<0.05)。 4、利塞膦酸钠逆转骨髓间充质干细胞成脂分化过程中RANKL/OPG的表达 利塞膦酸钠在人骨髓间充质干细胞成脂分化过程中呈浓度依赖性抑制RANKL水平的表达。Westen Blot结果显示：与对照组相比,不同浓度的利塞膦酸钠(1～25μmol/L)分别作用于成脂诱导的骨髓间充质干细胞,利塞膦酸钠呈剂量依赖性抑制骨髓间充质干细胞成脂过程中RANKL/OPG的表达(P<0.05)。 5、利塞膦酸钠对未成脂诱导的骨髓间充质干细胞表达的RANKL/OPG蛋白表达无影响 未成脂诱导的人骨髓间充质干细胞以利塞膦酸钠进行干预。Westen Blot结果显示：利塞膦酸钠不能影响骨髓间充质干细胞RANKL/OPG表达。 6、利塞膦酸钠抑制脂肪细胞来源的炎症因子分泌 ELISA结果显示：浓度为10μimol/L的利塞膦酸钠干预成脂诱导的骨髓间充质干细胞36h后,与对照组相比,IL-1、TNF-α表达显著降低(P<0.05),IL-6的表达也有下降,但与对照组比较无统计学意义。7、利塞膦酸钠抑制骨髓间充质干细胞成脂分化时m TORC1信号通路被抑制。 Westen Blot结果显示：与对照组相比,成脂诱导、利塞膦酸盐干预24h的骨髓间充质干细胞的PS6表达受到显著抑制。 结论：通过细胞实验证明,利塞膦酸钠可以通过下调骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞RANKL/OPG及炎症因子的表达,进而抑制破骨细胞的分化,减少骨丢失,发挥抗骨质疏松作用。