清开灵有效组分对大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤炎症反应的影响

凡是研究对于中枢系统疾病作用与机制的药理工作难以回避“药物是否能够通过血脑屏障”的问题。 脑缺血再灌注后可激活炎症反应,这是由大量细胞毒性成分诱导的氧自由基和其他介质导致细胞因子和致炎症酶原产生的结果,再灌注的炎症反应可促进微血管或小动脉的痉挛、甚至新血栓的形成,进一步扩大了脑损伤的范围,这是脑再灌注损伤的主要原因之一。以上两点是现代生命科学的两个基本生理、药理和病理规律,也是研究清开灵治疗脑血管病面对的基本的问题。 本课题为国家重点基础研究发展规划(973)项目“祛邪扶正方剂的研究-清开灵阻抑中风病缺血级联反应的药效物质与作用机理”(课题号 G1999055404)的一部分。课题组前期通过有效组分的特征研究和整体药理模型确定了清开灵原方中胆酸、黄芩苷、栀子苷、珍珠母水解液四种有效组分,组成了新的清开灵小复方。 目的 研究大鼠脑微血管内皮细胞(MVEC)体外模拟缺血再灌注损伤过程中相关粘附分子、蛋白酶及调控因子的表达变化,探讨清开灵有效组分和复方在保护血脑屏障微血管内皮细胞(细胞学)途径上阻抑脑缺血级联炎症反应的细胞分子生物学机理,为中风病“毒损脑络”病机和“解毒通络”“祛邪扶正”给予新的内涵阐释。 方法 1.大鼠脑 MVEC 的原代培养研究:以分离脑微血管段、胶原酶消化的方法提取大鼠脑微血管内皮细胞,进行纯化和传代培养。并经倒置显微镜下细胞形态观察,Ⅷ因子免疫细胞化学检测和扫描电镜鉴定。 2.清开灵有效组分透过体外模拟血脑屏障的研究:应用单层内皮细胞培养模型体外模拟血脑屏障,以质谱/色谱联合技术对清开灵有效组分 24h 内透过血脑屏障的成分和含量进行分析。 3.大鼠脑MVEC体外缺血再灌注模型的建立:以缺氧缺糖(95%N2,无糖Kreb溶液)再复氧复糖(空气,高糖DMEM)的方法建立体外模拟缺血再灌注损伤模型;以细胞形态学改变和MTT实验作为评价工具。 4.清开灵有效组分对大鼠 MVEC 体外缺血再灌注损伤炎症反应的干预作用研究:①采用 MTT 比色法测定细胞生存活性的变化。②采用硝酸还原酶法测定对细胞培养上清液中 NO 含量的影响。③对细胞粘附分子 ICAM-1、VCAM-1 的影响:以免疫细胞化学染色的方法研究微血管内皮细胞产生细胞粘附分子蛋白变化,以 RT-PCR 研究其基因表达的改变。④对细胞核转录因子-ΚB 的影响:免疫细胞化学染色方法,观察阳性表达核移位的改变。⑤以 RT-PCR 方法半定量研究对细胞 MMP-9mRNA 表达的影响。 结果 - 2 - 清开灵有效组分对大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤炎症反应的影响 1.培养的大鼠脑 MVEC 呈梭形或多角形,单层汇合呈铺路石征象;Ⅷ因子免疫细胞 化学染色阳性,扫描电镜可见细胞表面丰富的微绒毛,胞间形成紧密连接。经鉴定符 合脑微血管内皮细胞的特征。 2.栀子苷、牛胆酸、猪脱氧胆酸、去氧胆酸具有透过体外 BBB 模型的能力,24h 的透过率分别为:(26.22±0.41)%,(20.28±1.6)%,(13.34±0.95)%,(10.88±0.59) %;黄芩苷在此检测体系中不稳定,未检测到。 3.以缺氧缺糖(95%N2,无糖Kreb溶液)4 小时再复氧复糖(空气,高糖DMEM)12 小时的方法建立体外模拟缺血再灌注损伤模型,模型组细胞在氧糖剥夺 4 小时OD值与 正常组无显著性差异(P>0.05),再灌注 12 小时显著低于正常组(P<0.01)。 4.MTT细胞生存活性比较中,清开灵有效组分栀子苷、黄芩苷、牛胆酸、猪胆酸 12.5 μg·mL -1 ,小复方 0.03%浓度组OD值显著高于模型组(P<0.05),珍珠母水解液 0.03% 浓度组,清开灵 0.1%浓度组有一定提高细胞生存活性作用。 5.与模型组比较,除清开灵全方外,各组都有明显降低培养上清液中 NO 含量的作 用(P<0.05)。 6.清开灵各组分能显著降低 ICAM-1 蛋白的表达(P<0.01);在 mRNA 的转录水平 上,猪胆酸和小复方具有明显的抑制作用(P<0.05),牛胆酸、黄芩苷、栀子苷、珍 珠母水解液和清开灵原方有降低表达的趋势。清开灵各有效组分及复方在抑制 VCAM-1 的表达方面效果是显著的,抑制蛋白和基因表达的作用趋势一致(P<0.01)。 7.清开灵各组分和复方都具有明显的抑制转录因子 NF-ΚB 核移位的作用。 8.清开灵有效组分中黄芩苷及小复方能显著降低 MMP-9mRNA 的表达(P<0.05), 栀子苷、珍珠母水解液、猪胆酸和清开灵原方的作用不明显;而牛胆酸组的表达高于 模型组(P<0.05)。 结论 通过以上实验,结合中风病“毒损脑络”理论,综合分析认为: 1.脑微血管内皮细胞和脑络在功能上(或结构上)有一定的相似性,以现代细胞 培养技术获得的脑微血管内皮细胞,可能是体外研究脑络脉复杂结构系统的重要物质 载体,是中风病“毒损脑络”病变的现代生物学基础之一。 2.缺血再灌注损伤后细胞的生存数量减少,活性下降,微血管内皮细胞的损伤可 以理解为“络损”,是毒损脑络发生的病理基础。 3.NF-ΚB在病理因素刺激下活化,而损伤的内皮细胞产生的ICAM-1、VCAM-1、 NO、MMP-9等,它们都是在正常生理状态下不表达或微量表达的物质,在缺血性中风病 理过程表达显著增高的,这些都是疾病状态下的内生“毒邪”。它们对脑组织的直接损 伤作用和通过介导白细胞与内皮细胞粘附而引发的炎症瀑布效应是“毒损脑络”的病 理过程。 4.清开灵有效组分中栀子