钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ通路介导石菖蒲有效成分抗神经细胞凋亡

一、研究目的 中药石菖蒲为天南星科植物石菖蒲的根茎,有开窍宁神的功效,研究表明石菖蒲醒脑开窍和保护神经细胞的有效成分主要是挥发油中的β-细辛醚和丁香酚。β-细辛醚和丁香酚能抗神经细胞凋亡,但其分子机制尚不清楚。 钙调蛋白是Ca2+的受体蛋白,活化的CaM经Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶途径。CaMKⅡ主要表达于神经组织,其与神经细胞凋亡有着不可分割关系。 在前期工作基础上,发现石菖蒲上调CaMKⅡ的表达,因此本实验进一步探讨CaMKⅡ通路能否介导石菖蒲有效成分抗神经细胞凋亡及其作用机制。 二、实验方法和内容 实验一石菖蒲有效成分对A-β(淀粉样蛋白)诱导的原代海马神经细胞凋亡的影响。本实验分为两部分,第一取胎鼠的海马组织进行原代海马神经细胞的培养,培养第六天用A-p作用于细胞进行细胞模型建立,24小时后再给石菖蒲有效成分β-细辛醚和丁香酚作用于细胞。3天后提取蛋白进行western blot检测。第二应用CaMKⅡ抑制剂阻断CaMKⅡ通路,观察CaMKⅡ通路在石菖蒲有效成分抗神经细胞凋亡中作用,加入CaMKⅡ抑制剂作用于原代海马神经细胞,探讨CaMKⅡ通路介导石菖蒲有效成分抗神经细胞凋亡的作用。 实验二CaMKⅡ表达质粒和CaMKⅡ干扰质粒转染PC12细胞,观察CaMKⅡ在石菖蒲有效成分抗PC12细胞凋亡中的作用。本实验采用EndoFectinTM-Plus试剂瞬时转染CaMKⅡ的表达质粒,提取转染后的PC12细胞蛋白,运用Western blotting观察β-细辛醚对PC12细胞CaMKⅡ等及凋亡通路相关蛋白的表达情况；用同样的转染方法,对CaMKⅡ基因沉默。运用Western blotting观察β-细辛醚对PC12细胞CaMKⅡ等及凋亡通路相关蛋白的表达影响。 实验三CaMKⅡ通路在石菖蒲抗脑缺血皮层神经凋亡中的作用。进行在体模型的建立,建立脑缺血模型大鼠,设立正常对照组、模型组和药物组,各组分别用β-细辛醚、丁香酚静脉注射处理。十天后进行灌注取材和取脑匀浆,进行Western blotting检测。 三、实验结果 实验一第一部分β-细辛醚和丁香酚组的CaMK2a, CREB1, P-CREB蛋白的表达水平均高于空白对照组和模型组,而β-细辛醚和丁香酚组的BCL-2蛋白水平高于模型组,β-细辛醚和丁香酚组的Caspase3蛋白的表达水平均低于于空白对照组和模型组。第二部分不加CaMKⅡ抑制剂组的CREB、P-CREB蛋白的表达水平均高于加CaMKⅡ抑制剂组。 实验二CaMK转染后的CaMK2a、CREB、P-CREB、BCL-2蛋白的表达水平均高于转空载体组,且加入β-细辛醚诱导后的CaMK2a、CREB、P-CREB、BCL-2表达水平又高于单纯转染CaMK组。CaMK沉默基因转染后的CREB、P-CREB蛋白的表达水平均低于所有蛋白表达水平,且转染沉默基因同时加入β-细辛醚后表达也没有明显增加。 实验三β-细辛醚和丁香酚组的CREB、BCL-2蛋白的表达水平高于加脑缺血模型组；β-细辛醚和丁香酚组的Bax、Caspase3比模型组的蛋白的表达水平降低。 四、结论 CaMKⅡ信号通路是抗神经细胞凋亡的重要通路,石菖蒲有效成分β-细辛醚和丁香酚通过调控凋亡基因的表达,对神经细胞的损伤具有一定的保护作用。得出结论：CaMKⅡ信号通路介导石菖蒲有效成分上调CaMKⅡCREB1和BCL-2的表达,下调促细胞凋亡分子Bax、Caspase3的表达有效的抗神经细胞凋亡,保护神经细胞。