目的：优选蝉蜕抗凝纤溶活性组分的提取方法,分离纯化蝉蜕该活性组分,对其进行定性分析及稳定性研究,并考察抗凝活性组分对人脐静脉血管内皮细胞的保护作用,探索蝉蜕抗凝纤溶的物质基础。
方法：①以PT、APTT、血小板聚集率和血凝-纤溶动态图为指标,比较蝉蜕仿生胃/胰酶解物、水提物、醇提物、水提醇沉物的抗凝与纤溶活性差异,综合评价各提取物抗凝纤溶活性。②PT、APTT、TT、FIB辅以280nm蛋白质检测方法,通过葡聚糖凝胶G-50、G-25、G-10分离蝉蜕胃蛋白酶解物。③以双缩脲反应进行蛋白质定性考察,以HPLC进行纯度考察,通过MALDI-TOF-MS质谱图分析所得活性组分的分子量范围；以PT、APTT、TT为指标考察60℃真空干燥、-20℃冷冻干燥、-80℃冷冻干燥对活性组分稳定性的影响；以APTT为指标考察pH2-7外环境对活性组分稳定性的影响。④以细胞毒性试验,LDH泄漏率,MDA、NO、SOD、GSH-Px等含量为指标,考察分离所得抗凝活性组分对过氧化氢诱导损伤内皮细胞的保护作用。
结果：①PTT、血小板聚集率、血凝-纤溶三项指标显示,仿生胃/胰蛋白酶解物和水提醇沉(渣)均表现出显著的抗凝作用,但无延长PT效果,选择胃蛋白酶解物进行后续研究。②经葡聚糖凝胶G-50、G-25、G-10分离蝉蜕胃蛋白酶解物,得到抗凝活性组分F2-2-2。③双缩脲检测结果为紫褐色,表明F2-2-2为蛋白或多肽类物质,纯度以色谱峰面积计76.06%,F2-2-2分子量范围为700-1500Da,特征分子峰为1216.29Da。-80℃冷冻干燥法体外抗凝指标低于空白组,60℃真空干燥法和-20℃冷冻干燥法体外抗凝指标显著高于空白组,-20℃冷冻干燥法抗凝血药效接近浓缩液,为适合抗凝组分的干燥方法。当外环境pH=2时,F2-2-2显著延长APTT；pH≥3时,有絮状不可逆沉淀析出,APTT延长效果减弱；当pH≥5时,抗凝组分不能延长APTT值,并表现出促进凝血效果。④F2-2-2在0.25-0.5mg/ml范围内预孵人脐静脉血管内皮细胞24-72h,显示能显著改善过氧化氢损伤造成的LDH泄漏率增高,MDA和NO释放增高、SOD和GSH-Px抗氧化活性降低。当F2-2-2浓度>4mg/ml,在NO和GSH-Px方面表现出加重氧化损伤现象,当浓度>20mg/ml,细胞存活率小于1%。
结论：本实验证明蝉蜕仿生酶解提取物与水提醇沉渣较其他提取物具有良好体外抗凝血效果,并从蝉蜕胃蛋白酶解物中分离纯化得到抗凝血多肽组分F2-2-2,验证其对人脐静脉血管内皮细胞氧化损伤具有保护作用。从中药多靶向角度,揭示了蝉蜕多肽类组分治疗冠心病潜力,并以稳定性研究为其制剂奠定了基础。
