中药的药效物质辨识与质量控制研究一直是中医药研究的重点,也是影响中医药现代化发展的关键问题。为了准确地、快速地找出药效物质,更好地控制中药的质量,本文借用成分敲出/敲入的思想,针对黄连的药效物质辨识和质量控制模式进行研究,建立了一套完善的黄连抗菌(痢疾杆菌Shigella dysenteriae)的药效物质研究及质量控制的模式。
主要研究内容和结果如下：
(1)不同来源、品种的黄连生物碱成分含量波动较大
采用HPLC分析不同来源、品种的黄连水提物中主要生物碱成分含量信息。结果显示：黄连各生物碱的含量存在显著差异,且不同品种的黄连中总生物碱含量也呈较明显的品种性差异。
(2)化学分析法与生物活性检测法联用,有助于药效物质的发现
采用HPLC法测定了3个品种、6个浓度共18个黄连样品的化学信息；采用微量量热法比较各黄连样品对痢疾杆菌生长代谢的影响,并用主成分分析法对所有样品的生物热活性参数进行分析。结果发现：3种黄连抑菌效果存在明显差异,抑菌活性以云连最强,味连次之,雅连最弱。用典型相关分析法分析化学指纹谱信息与生物指纹图谱信息,结果显示：与抑菌活性存在密切的相关性化学成分是小檗碱(Ber)、黄连碱(Cop)、药根碱(Jat)、巴马汀(Pal),与药典所规定的黄连指标性成分一致。
(3)通过黄连各成分逐一敲出,筛选出了黄连中主要的抗菌药效物质
利用TLC对黄连样品进行分离,确定6个需要“敲出”的目标成分是：非洲防己碱(Col)、Jat、表小檗碱(Epi)、Ber、Pal、Cop;采用UPLC-MS对“敲出”成分及其阴性样品进行鉴定,评价“敲出”工作的彻底性及检测“敲出”前后各物质成分是否发生变化。结果显示：各敲出目标成分均被很好的分离出来,阴性样品中无残留；各目标成分敲出前后的离子碎片相同,说明TLC分离没有破坏各目标成分的化学结构。
利用微量量热法考察与评价同浓度各敲出目标成分抑制活性强弱顺序为：Cop> Ber> Epi> Jat+Col> Pal>非生物碱部分；在黄连水提液自然配比下,6种生物碱对痢疾杆菌生长代谢均有一定的抑制作用,且以黄连碱与小檗碱的抑菌活性最强。考察各敲出成分间的作用关系发现非生物碱部分对黄连的抑菌活性有一定的拮抗作用；比较6种生物碱间的相互作用发现小檗碱与黄连碱存在协同作用,而叠加作用存在于其他4种生物碱与小檗碱和黄连碱的药物活性之间。
(4)通过已确定的关键药效物质的敲入,确定了黄连药效物质的含量限度
将已确定的小檗碱和黄连碱“递增敲入”到各阴性样品中,采用HPLC和热动力学分析法对不同浓度的“敲入”样品进行化学分析与生物活性评价,初步制定小檗碱和黄连碱适宜的范围为8.08%-31.92%和4.05%-14.45%。
(5)确定小檗碱和黄连碱的最佳剂量配比,为黄连“组分中药”的研制提供新思路和路径
采用棋盘法设计,荧光吸收法来评价黄连碱与小檗碱不同配比作用下的抑菌活性强弱,找出了黄连碱与小檗碱的最佳剂量配比为2：1,相对较优配比为：4：1,1：2,1：4。
本研究利用成分敲出／敲入的研究模式,初步建立黄连的药效物质的筛选模式与质量控制模式,并发现黄连主要的抗痢疾杆菌的药效物质,制定出其含量限度范围及其最佳剂量配比,为黄连的质量控制标准的进一步发展和完善提供参考,同时也为未来中药的重点的研究方向——药效物质辨识和质量控制研究提供了新的研究思路与方法。
