ERK1/2蛋白信号在BPD新生鼠肺成纤维细胞增殖、转化及迁移中作用的研究

目的:随着肺泡表面活性物质的早期预防性应用,呼吸支持的大力开展,以及早产儿静脉营养等支持水平的增强,早产儿,尤其是极低和超低出生体重儿的生存率得到了大大的提高,但随之而来,由于发育不成熟的肺脏长期对氧气的依赖,导致新生儿支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia,BPD）的发生率也在逐年增加,成为威胁极低与超低出生体重儿健康的重要疾病。据报道,美国每年新增约1万的BPD患儿。目前,新生儿BPD的发病机制仍不十分清楚,尚缺乏有效的预防及治疗手段,其长期生活质量也受到严重的影响。约10～15%的BPD患儿,生后1年内可出现严重的肺纤维化,甚至因呼吸衰竭而死亡。而且大部分的BPD患儿即使新生儿期顺利出院,也会因反复出现的呼吸道感染、气道的顺应性降低、肺功能障碍而多次住院治疗。至今为止,BPD的发病机制尚不完全清楚,但其最终病理结局主要表现为肺泡发育障碍及肺间质纤维化的形成。在肺组织的损伤修复过程中,纤维组织的增生替代是必不可少的病理生理途径,但肺成纤维细胞（lung fibrolast,LF）若过度增殖,沉积于肺间质,替代正常的肺上皮细胞,反而可导致肺间质纤维化。因此,在肺组织修复过程中,如何有效的调控LF的增殖,使之有效修复组织的同时,也不会过度增生而导致肺纤维化,就成为防治BPD的关键。而这一问题的解决,则必须从LF增殖的调控机制着手。丝裂原活化蛋白激酶超家族（mitogen activated protein kinase,MAPK）是大多数真核细胞内广泛存在的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是将细胞外信号转导到细胞内,从而引起一系列细胞反应的重要的信号传导系统。目前,哺乳动物MAPK家族中已发现有6大类至少11个成员。即p38s(α/β/γ（ERK6）/δ),c-Jun氨基末端激酶（c-Jun amino terminal kinase,JNK）1/2/3和细胞外信号调节蛋白激酶（extracellular signal regulated protein kinase,ERK）1/2,ERK3/4,ERK5,ERK7/8。ERK是所有MAPK家族成员中最早被认识,而且是最具特征性的,是一种增殖、转化和分化MAPK。持续的ERK激活能促进细胞自G1期进入S期,与肿瘤的发生密切相关。因此我们推测“高氧—ERK1/2蛋白信号转导通路激活—LF增殖异常增加—BPD肺纤维化”可能存在一定的因果关系。本研究在我们既往研究的基础上,建立长期吸入氧气致BPD新生大鼠动物模型,并取原代培养的LF为直接研究对象,观察氧气对LF增殖及Ⅰ型胶原合成的影响,以多种方法探索ERK1/2信号转导通路在BPD肺纤维化发生发展中的动态变化,并从多角度研究ERK1/2激动剂及抑制剂对体外培养LF增殖、转化及迁移的调控。为深入探索BPD肺纤维化的发生机制提供新线索,也为阐明新生儿BPD防治的新途径奠定理论与实验基础。研究方法:1、BPD动物模型制备及原代LF培养将新生的Wistar仔鼠生后随机分为高氧组及空气组,并于实验后的3天,7天,14天,各组随机选取8只,分离左肺组织用于免疫组织化学染色观察肺组织形态。分离右肺组织进一步行Western blot及Real-time PCR等实验方法的检测。并分离纯化各组LF进行原代培养。同时取正常新生鼠肺LF,实验时细胞处于对数生长期,活细胞数超过95%,应用无血清的DMEM培养基饥饿培养24小时后,用正常含10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养,并分组。对照组:空白对照;PD98059组:加入ERK抑制剂PD98059（10nmol/ml）;EGF组:加入ERK激活剂EGF（20ng/ml）;EGF+PD98059组:先加入PD98059,1小时后加入EGF。24h后收集细胞。2、实验方法及检测指标2.1高氧对LF增殖及Ⅰ型胶原合成影响的研究应用流式细胞技术检测各组肺成纤维细胞的周期;免疫组织化学染色技术检测PCNA增殖细胞核抗原表达;ELISA检测各组肺成纤维细胞培养液上清中Ⅰ型胶原蛋白含量;Real-time PCR:检测肺成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达水平。2.2.各组肺组织及成纤维细胞ERK1/2表达的动态变化应用免疫组织化学染色技术检测各组肺组织及成纤维细胞p-ERK1/2蛋白的表达;Western blot技术检测各组肺组织及成纤维细胞ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表达;Real-time PCR检测各组肺组织及成纤维细胞ERK1、ERK2的mRNA表达水平。2.3 ERK激活剂及抑制剂对肺成纤维细胞的体外实验研究应用免疫组织化学染色、Western blot技术及Real-time PCR方法分别检测各组肺成纤维细胞ERK1/2蛋白及mRNA的表达;CCK-8法检测各组肺成纤维细胞的增殖状态;流式细胞技术检测各组肺成纤维细胞的周期状态;免疫组织化学染色检测各组肺成纤维细胞PCNA增殖细胞核抗原表达;应用免疫组织化学染色、Western blot技术及Real-time PCR技术检测各组肺成纤维细胞α-SMA表达,反映细胞转化状态;transwell小室法检测各组细胞的迁移能力。3、统计学分析应用SPSS13.0统计软件分析,数据结果用Mean±SD表示。计量资料两组间比较采用t检验;多组间比较采用ANOVA单因素方差分析。显著性检验水平为0.05。结果:1、各组肺成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原合成的研究1.1细胞周期的变化:流式细胞仪分析显示,高氧7d的LF细胞处于DNA合成期（S期）细胞比率与空气组7d相比有所增加（p<0.05）,而DNA合成前期（G0/G1期）细胞比率降低。高氧14d组与空气14d组相比,这一趋势显得更加明显（p<0.01）。1.2 PCNA增殖细胞核抗原表达:高氧3d组细胞的增殖速度较其对应的空气组无明显差异,高氧7d组细胞的增殖速度快于空气组（p<0.01）,高氧14d组与对应的空气组相比细胞的增殖速度明显加快（p<0.01）。空气组各组之间细胞的增殖速度差异不明显。1.3Ⅰ型胶原在细胞培养液上清中蛋白的表达:与对照细胞相比,高氧7dⅠ型胶原蛋白水平开始有所增加（p<0.05）,而14d时更加明显（p<0.01）。1.4Ⅰ型胶原在各组肺成纤维细胞中mRNA的表达:与对照细胞相比,高氧3、7、14d组Ⅰ型胶原mRNA水平均明显增加,统计学水平差异显著（p<0.01）。2、各组肺组织及成纤维细胞ERK1/2表达的动态变化2.1免疫组化法检测p-ERK1/2蛋白的表达高氧3d组与对应的空气组相比,组织及细胞的p-ERK1/2蛋白的表达无明显差异（p>0.05）,而高氧7d组开始增加（p<0.01）,14d组明显增加（p<0.01）。2.2 Western blot法检测ERK1/2及p-ERK1/2蛋白的表达高氧3d组与对应的空气组相比,组织及细胞的p-ERK1/2蛋白的表达无明显差异（p>0.05）,高氧7d组开始增加（p<0.01）,14d组明显增加（p<0.01）。而各组间ERK1/2蛋白表达水平无明显差异（p>0.05）。2.3 real-time PCR法检测ERK1/2mRNA表达各组间ERK1及ERK2 mRNA表达水平无明显差异（p>0.05）。3、ERK激活剂及抑制剂对肺成纤维细胞的体外实验研究:3.1 ERK1/2表达的变化免疫组织化学技术:加入EGF（20ng/ml）后24h,细胞p-ERK1/2表达水平增加显著（p<0.01）,此时PD98059（10nmol/ml）可使p-ERK1/2的水平降低（p<0.01）。Western blot技术:加入EGF（20ng/ml）后24h,细胞p-ERK1/2表达水平增加显著（p<0.05）,此时PD98059（10nmol/ml）可使p-ERK1/2的水平降低（p<0.01）。各组间ERK1/2蛋白表达水平统计学上均无明显差异（p>0.05）。Real-time PCR法检测ERK1/2 mRNA表达:各组间ERK1及ERK2 mRNA表达水平统计学上均无明显差异（p>0.05）。3.2 ERK激活剂及抑制剂对LF增殖的影响CCK-8比色法显示:与对照组相比,PD98059组及EGF+PD98059组在加入PD98059后6h、12h,细胞增殖均明显受到抑制（p<0.05）;而EGF组在加入EGF后24h细胞增殖才开始增加（p<0.05）,此时PD98059组的抑制作用达到高峰（p<0.01）,而EGF+PD98059组亦呈抑制状态（p<0.01）。流式细胞仪测细胞周期结果显示,LF在EGF处理后出现明显的增殖,S期细胞所占的比例增加（p<0.01）,而G0/G1期细胞所占的细胞比例出现减少（p<0.01）;此时PD98059（10nmol/ml）可降低细胞的增殖水平（p<0.01）,使细胞处于G0/G1期阻滞状态,从而拮抗EGF对细胞增殖的促进作用（p<0.01）。PCNA增殖细胞核抗原表达:可见EGF处理后LF的PCNA抗原表达明显增加（p<0.01）,而加入PD98059后可明显抑制正常LF的PCNA抗原的表达（p<0.01）。3.3 ERK激活剂及抑制剂对LF分化的影响免疫组织化学技术及Western blot技术测定α-SMA的蛋白表达:加入EGF（20ng/ml）后24h,细胞α-SMA蛋白表达水平增加显著（p<0.01）,此时PD98059（10nmol/ml）可使α-SMA的水平降低（p<0.01）。PD98059可明显抑制EGF的作用（p<0.01）。Real-time PCR法检测α-SMA的mRNA表达:加入EGF（20ng/ml）后24h,细胞α-SMA的mRNA表达水平增加显著（p<0.01）,此时PD98059（10nmol/ml）可使α-SMA的mRNA水平降低（p<0.01）。PD98059可明显抑制EGF的作用（p<0.01）。3.4 ERK激活剂及抑制剂对LF迁移的影响transwell小室显示:加入EGF（20ng/ml）后12h,细胞的迁移能力明显增强（p<0.01）,而PD98059（10nmol/ml）可明显抑制细胞的迁移能力。PD98059可明显抑制EGF的作用（p<0.01）。结论:1、高氧可促使更多的细胞进入S期,细胞的增殖速度明显加快。2、高氧促进肺成纤维细胞合成、分泌Ⅰ型胶原增加,可能最终导致BPD鼠肺纤维化。3、高氧可诱导新生鼠肺成纤维细胞的ERK1/2蛋白水平磷酸化活化,但基因水平变化不明显。活化的p-ERK1/2可能是LF过度增殖的关键。4、应用ERK的激动剂及抑制剂对肺成纤维细胞的体外研究证实ERK1/2是调控LF增殖,转化及迁移的重要转导信号。