山药不同基因型地下块茎糖类和酚类物质形成、调控及相关基因分离的研究

山药（Dioscorea spp．）为薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属中多年生缠绕性草质植物，其地下块茎富含糖类和酚类物质，普遍用作粮食、药物和生物质能源的原料。迄今已知约有600个山药物种，其中世界上广泛种植的约有10个，而我国大陆地区仅有田薯（D．alata L．）、普通山药（D．opposite Thunb．）和日本山药（D．japonica Thunb．）等3个。山药地下块茎化学成分的组成和含量因基因型和生长环境而异，所以，收集和分类我国主栽山药品种并阐明它们地下块茎糖类和酚类物质形成机理，对人类获得更多高品质山药产品予以消费具有重要意义。本研究以‘紫小’、‘紫大’、‘白扁’、‘白柱’、‘普通’、‘野生’等六种山药基因型为材料，首先，应用山药形态特征多态性、地下块茎可溶性蛋白多态性和SRAP分子标记多态性对它们进行分类评价；其次，运用生理生化手段对它们地下块茎主要糖类和酚类物质的含量及其形成的主要酶活性进行了测定和比较，同时，利用分子生物学技术从六种基因型地下块茎中分离了编码这些主要酶结构基因的cDNA序列，其中重点对‘紫小’的相关基因全长cDNA序列进行了克隆和描述；最后，运用生理生化手段分析了‘紫小’、‘白扁’和‘普通’分别经0．5、1．0、5．0 mmol·L-1的SA叶喷后地下块茎主要糖类和酚类物质的含量及其形成的主要酶活性；此外，还初步分析了山药糖类和酚类物质形成的可能关系。通过上述研究，获得了以下主要结果： （1）形态学特征多态性、地下块茎可溶性蛋白多态性和SRAP分子标记多态性等三种方法都能以鉴别率为100%的效果将六种山药基因型完全区分为结果相同的3类；‘紫小’、‘紫大’、‘白扁’、‘白柱’属于山药田薯种（D．alata L．），其中还可分为田薯紫色类型和田薯白色类型，前者包括‘紫小’和‘紫大’，后者包含‘白扁’和‘白柱’；‘普通’和‘野生’分别属于普通山药（D．opposite Thunb．）和日本山药（D．japonica Thunb．）。比较这三种分类方法，它们的多态性比率依次为65．45%、67．70%、89．32%，基因型间的遗传相似性系数为0．63～0．96、0．54～0．94、0．36～0．73，遗传距离为0．04～0．37、0．06～0．46、0．27～0．64，其中4个田薯的平均遗传距离分别是0．11、0．15、0．39，这些结果表明SRAP分子标记对上述六种基因型的分类更精细，更适用于山药种质资源的遗传多样性分析和分类。 （2）六种山药基因型地下块茎干物质都一直增加，其中田薯白色类型最早积累，‘普通’最迟；AM、AP、Cel和TSS构成地下块茎DW的50%以上，其中仅AM、AP收获时分别占Dw的28．3%～39．1%、34．7%～43．7%；AM、AP的演进总趋势和DW的一样，但Cel、TSS、Suc、TRS、Glc、Frc、TS表现相反；尽管‘野生’的DW、各种可溶性糖、Cel含量都为最小，但是在DC、TS、AM、AP的含量在盛中期前为最大；‘普通’在盛中期前TS、AM和AP的含量最低，但是收获时最大；田薯除Suc含量一直最大外，其他糖类物质含量介于‘普通’和‘野生’间；与可溶性糖和AM相反，DW、TS、AP和Cel在田薯白色品种中较在紫色品种中有更多的含量。SAI、IAI和NI的活性总趋势都是降低，而SuSy增至盛期最大后再降低；转化酶活性都低于SuSy活性，尤其块茎形成初期后；在整个取样时期里，与SAI相反，NI和IAI的活性在‘普通’和‘野生’中高过在田薯中；SuSy活性在‘野生’中都为最低，虽然在块茎形成初期田薯都大于‘普通’，但‘普通’收获时达最大；与IAI、SuSy相反，SAI、NI在田薯紫色品种中的活性大于田薯白色品种的。AGPase、SSS的活性演进模式在同基因型中相似，即‘普通’的一直递增，而其他基因型的增至块茎形成初期或盛期最大后再减至收获；GBSS、SBE的活性变化总趋势在各基因型中均随生育进程而增加，其中在‘普通’、‘野生’中一直递增，虽然田薯在块茎盛后期前也一直递增，但此后SBE与GBSS不同，表现稍有减少。各时期AGPase、SSS、GBSS、SBE的活性在‘野生’中都是最低，在初期虽然‘普通，/小于‘田薯’，但后期则反之；除SBE外，其他三种酶都是田薯的白色品种大于紫色品种。上述除Cel外的糖类化合物含量和相关酶活性在田薯类型内都是‘紫大’大于‘紫小’和‘白扁’大于‘白柱’。方差分析结果显示上述生理生化指标在种间和田薯类型间大多数时期差异显著，但是在田薯类型内大多数时期不显著。同时，Suc虽然和SuSy及淀粉合成相关的酶活性相关性不显著，但是Suc/TSS、Suc/TRS和这些酶活性的正相关性大部分显著。这些结果表明，六种山药基因型地下块茎干物质主要由AM、AP、Cel和TSS构成；各基因型山药地下块茎转化酶和SuSy的活性都存在，转化酶尤其SAI在块茎形成初期有较高的活性，此后SuSy一直是蔗糖裂解的优势酶而导致地下块茎库力的不同；淀粉的基因型著异主要由AGPase、SSS活性的基因型差异所致；各种糖类物质与相关酶活性密切相关，其中蔗糖通过Suc/TSS、Suc/TRS的形式正调控SuSy和淀粉合成相关酶；根据干物质和淀粉积累情况，各基因型熟期依次为田薯白色品种（‘白扁’和‘白柱’）、田薯紫色品种（‘紫大’和‘紫小’）、‘野生’、‘普通’。 （3）设计三对简并引物和一些特异引物，运用传统RT-PCR和RACE技术从六种基因型山药地下块茎中都能克隆到SuSy、AGPase和SSS的同源基因cDNA片段，而且三者在各基因型的长度分别为830 b p、784 bp和1 104 bp，可推定编码276、261和367个氨基酸，分别利用这三类同源基因的cDNA序列片段进行同源性比对和系统聚类分析，结合前面基因型分类结果显示，SuSy、AGPase、SSS同源基因的分子系统进化关系一定程度上能反映了山药六种基因型间亲缘关系的远近和进化的快慢。同时，重点对‘紫小’地下块茎的SuSy同源基因cDNA全长进行克隆和分析，DaSuSy1全长cDNA序列大小为2 673bp，其中最大开放阅读框（ORF）、5’端和3’端的非翻译区分别含有2 445 bp、7bp和221 bp，而且3’端的非翻译区含一个24 nt的Poly（A+）尾；最大ORF可编码814个氨基酸，分子量为92．76 kDa，等电点为6．42，含有SuSy和葡糖基转移酶两个保守功能域及两个磷酸化位点，即N端的Ser10和C端的SNLDRRET781RR(Ser774～Thr781)。该基因在全长cDNA序列、编码区cDNA序列及其编码氨基酸序列的水平上与GenBank中所选已知物种SuSy基因相应序列的同源性分别达45．3%～71．3%、45，8%～74．8%和50．0%～84．7%，与禾本科植物SuSy基因家族中一些成员亲缘关系最近。利用RT-PCR和Northern杂交技术对‘紫小’的DaSuSy1、DaAGPase1和DaSSS1进行表达分析，三个基因在叶片中均没有表达，但是在地下块茎中均有较高丰度的表达；在茎蔓和根中DaSuSy1有微弱表达，DaAGPase1、DaSSS1则完全不表达；DaAGPase1和DaAGPase1可能在转录后水平上受到调控，而DaSSS1可能主要在转录水上受到调控。 （4）用0、0．5、1．0、5．0 mmol·-1的SA在山药地下块茎形成初期和盛后期对‘紫小’、‘白扁’和‘普通’进行叶喷后，通过对TSS、Suc、Glc、Frc、TS、AM、AP、Cel的含量和SuSy、AGPase、GBSS的活性进行测定，结果显示0．5 mmol·L-1SA提高了所试山药基因型叶片合成Suc及其通过茎基部的量，从而提高了地下块茎除Cel外的所测生理生化参数的含量，尤其在块茎形成初期叶喷效果明显，5．0mmol·L-1则反之，而1．0 mmol·L-1在2个田薯品种中显现抑制，在‘普通’中表现促进；同基因型所测参数年间差异大多数不显著；在各基因型中虽然1．0 mmol·L-1的相关参数与对照的差异也多不显著，但是0．5、5．0 mmol·L-1和对照的差异大多数显著，而且同SA浓度基因型间也基本显著。这些结果表明，0．5 mmol·L-1有利于叶片Suc的合成、转运和在地下块茎中向淀粉转化，5．0 mmol·l-1则反之，1．0mmol·l-1的作用因基因型而异；三种SA浓度对相关生理生化参数都起平行协同促进或抑制的作用。SA对地下块茎干物质和淀粉积累的影响是通过凋控叶片合成蔗糖和运输而实现，而且蔗糖作为信号分子以Suc/TSS的形式来协同正调控地下块茎的SuSy、AGPase和GBSS的活性；SA各浓度在不同时间里叶喷对糖类物质形成也存在细微差异，为了有利于山药地下块茎干物质和淀粉的积累，适宜浓度的SA应在块茎形成的初期开始每隔30天左右连续叶面喷施，而且普通山药响应SA施用的剂量要高于田薯。 （5）设计一对简并引物和一些特异引物，运用普通PCR、RACE和TAIL-PCR技术，从六种基因型山药地下块茎中都能克隆到PAL同源基因cDNA的中间片段序列，利用这些序列进行同源性比对和系统分析，结合前面基因型分类结果显示，虽然可以将‘野生’、‘普通’和田薯的PAL同源基因区分开来，但是田薯4个品种得不到很好的分类，所以该基因不适合用来评价山药基因型的系统进化。同时，从‘紫小’地下块茎中克隆到一个长度为2 376 bp的PAL基因全长cDNA序列，该序列含有一个1 986 bp的最大ORF，一个28 bp的5’端非翻译区，一个362 bp中含25 nt的Poly（A+）尾的3’端非翻译区；最大ORF可推测编码一个包括PAL酶活性中心特征（GTITASGDLVPLSYIA）在内的661个氨基酸的多肽，分子量为71．974 kDa，等电点为6．310；DAPAL1和GenBank中已报道其他物种的PAL在全长cDNA序列、编码区序列及其编码氨基酸序列水平上有较高的同源性，都达到50%以上，而且DaPAL1在核苷酸水平上与双子叶植物的更接近，而在氨基酸水平上与单、双子叶植物的接近度著不多；通过用RT-PCR和Northern杂交对DaPAL1的表达进行分析表明，DaPAL1仅在地下块茎特异表达，而且在块茎形成的不同时期所表达的丰度有差异，在块茎形成的初前期表达量最大，此后表达有递减的趋势，直至收获时表达量又有所增加。各期表达丰度和PAL酶活性及总酚含量有正向协同性，说明DaPAL1可能主要在转录水平上受到调控。 （6）设计两对简并引物和一些特异引物，运用传统RT-PCR和RACE技术从六种基因型山药地下块茎中都能克隆到CHS和ANS的同源基因cDNA片段，两者在各基因型的长度分别为800 bp、280bp，可推定编码273、93个氨基酸，分别利用这两类同源基因的cDNA序列片段进行同源性比对和系统聚类分析，与前面基因型分类结果相比显示，尽管CHS同源基因的分子系统进化关系一定程度上能反映了山药六种基因型间亲缘关系，但是4NS同源基因不适合。同时，重点对‘紫小’地下块茎的ANS同源基因cDNA全长进行克隆和分析，DaANS1大小为1 387 bp，最大ORF、5’端和3’端的非翻译区分别由1 077 bp、9 bp和301 bp组成；DaANS1最大ORF可编码358个氨基酸，其分子量和等电点分别为40．4 kDa、5．26，并含有依赖于2-酮戊二酸和Fe2+氧化的保守结构域，其中包括与2-酮戊二酸特异结合的精氨酸2个(Arg295、304)及与Fe2+结合的保守组氨酸5个(His238、243、249、276、294)和天冬氨酸3个(Asp240、260、279)；DaANS1与所选被子植物ANS基因的同源性均远高于与裸子植物的同源性，而且与被子植物中双子叶旋花科植物ANS基因的亲缘关系最近，但仅能将属、种间植物合理分类，可评价属、种间植物的亲缘关系。利用RT-PCR和Northern杂交技术分析DaCHS1和DaANS1在‘紫小’中的表达显示，DaCHS1仅‘紫块茎和根中表达，在地下块茎中各时期表达均较强烈，在盛前期表达丰度最高；DaANS1在‘紫小’各个器官中均有表达，但地下块茎的表达总丰度要比根、地上茎和叶片的要强烈得多；DaCHS1、DaANS1可能在转录水平上受到调控。 （7）在整个生长发育过程中，TFD、TPA和TTN是山药地下块茎TPC的主要三大构成，分别是总酚的0．64～0．93、0．10～0．25、0．06～0．22，其中TAN和TFL构成大部分TFD；TAN、TFL在田薯紫色类型中分别占TFD的0．53～0．75、0．13～0．34，占TPC的0．49～0．68、0．11～0．29，而在其他基因型中则分别占TFD的0．02～0．1 8、0．55～0．86，占TPC的0．02～0．12、0．38～0．62；这些酚类化合物总变化趋势与干物质和淀粉变化趋势相反，随生育进程而下降，但是和TAC有密切协同性；田薯紫色类型含有高于其他基因型的TPC、TFD，其次是‘普通’和田薯白色类型，‘野生’最低；尽管田薯紫色类型仍含有最高的TAN，但是其TFL和TPA的含量仅稍大于‘野生’，反而是‘普通’和田薯白色类型有相对较高的TFL和TPA，说明山药地下块茎TPA和TFD及TAN和TFL有着竞争性的积累关系；这些酚类化合物在山药种间和田薯类型间差异也在大多数时期差异显著，但是在田薯类型内多数时期不显著。PAL、ANS的酶活性不但在变化趋势上而且在基因型比较结果上都类似于TPC、TAN。不同浓度SA对‘紫小’、‘白扁’和‘普通’的酚类化合物和相关酶的活性在变化总趋势上没有显著影向，但在叶喷后30天左右对这些生理参数的大小有一定作用，而且对各酚类化合物的含量及PAL和ANS的活性都是平行协同影响，其中0．5 mmol·L-1SA有促进作用，5．0 mmol·L-1则反之，而1．0 mmol·L-1在田薯中显现抑制，在‘普通’中表现促进；‘紫小’、‘白扁’和‘普通’的酚类化合物及其相关酶活性不但年间大多数时期差异显著，而且同处理基因型间的差异都显著，同基因型不同处理间的差异也多显著。同基因型的淀粉与各种酚类物质、PAL和ANS的酶活性极显著负相关，说明酚类物质和淀粉在形成时对蔗糖提供的碳素存在着竞争；酚类物质、PAL和ANS也受到蔗糖的调控，而且蔗糖作为信号分子通过Suc/TSS、Suc/TRS而作用；与SuSy的作用相反，转化酶尤其SAI似乎有利于酚类物质形成；SA处理后山药地下块茎糖类物质和酚类化合物的相互关系进一步说明酚类化合物种间差异是由于叶喷SA影响叶片蔗糖合成和转运所致。