瓯柑和胡柚果实黄酮类化合物组分鉴定、分离纯化及生物活性研究

本论文以瓯柑(Citrus reticulata cv. Suavissima)和胡柚(Citrus changshanensis)果实为材料,研究了果实不同部位黄酮类化合物的组分及含量,分离纯化了主要黄酮类化合物,并对果实提取物进行了抗氧化、抗肿瘤和抗糖尿病活性评价。主要结果如下： 1、从瓯柑果实中鉴定出八种黄酮类化合物,包括四种黄烷酮糖苷(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、枸橘苷)和四种多甲氧基黄酮(PMFs)(甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素)。从胡柚果实中鉴定出十种黄酮类化合物,包括六种黄烷酮糖苷(圣草次苷、新圣草次苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷)和四种PMFs (六甲氧基黄酮、川陈皮素、七甲氧基黄酮和橘皮素)。分析了瓯柑和胡柚果实四个不同部位的黄酮类化合物组成,黄烷酮在瓯柑和胡柚果实四个部位中均能检测到,而PMFs仅存在于果实油胞层中；白皮层中黄酮类化合物含量最高,其中新橙皮苷是瓯柑果实的主要黄酮类物质,而柚皮苷和新橙皮苷是胡柚果实黄酮的主要组分。抗氧化分析表明,瓯柑和胡柚四个部位粗提物均有一定抗氧化活性,其中油胞层具有最强的DPPH自由基清除活性；在瓯柑和胡柚果实贮藏期间(6℃,120d),黄酮类化合物在四个不同部位的组成变化不一然而总黄酮类化合物维持在较高的水平。 2、采用大孔树脂和高速逆流色谱(HSCCC)联用技术,建立了从瓯柑和胡柚白皮层快速有效分离纯化新橙皮苷和柚皮苷的体系。经过D101树脂一步纯化之后,新橙皮苷的纯度从4.70%增加至32.38%,柚皮苷的纯度从3.92%增加至38.07%;经过HSCCC两相溶剂体系氯仿-甲醇-正丁醇-水(4：3：1：2,v/v)进一步纯化后得到的新橙皮苷和柚皮苷纯度均在97%以上。利用溶剂萃取、SephadexLH-20凝胶过滤和HSCCC联用技术,建立了从瓯柑油胞层分离纯化三种黄烷酮(柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷)和四种PMFs (甜橙黄酮、川陈皮素、橘皮素和5-去甲川陈皮素)的体系。所有纯化产物经过HPLC和LC-MS进行鉴定确认。 3、对瓯柑和胡柚果实四个部位提取物开展抗肿瘤活性研究,结果表明瓯柑油胞层提取物对人肝癌细胞HepG2,白血病HL-60细胞和乳腺癌MDA-MB-231细胞均有显著的抑制增殖作用,胡柚提取物和瓯柑其他三个部位提取物的抗肿瘤活性不显著。进一步研究发现,瓯柑油胞层中的甜橙黄酮、川陈皮素,橘皮素和5-去甲川陈皮素对三种肿瘤细胞具有明显的抑制增殖作用,表明PMFs可能是瓯柑油胞层抗肿瘤的重要组分；两种黄烷酮苷元,即柚皮素和橙皮素也表现出显著的抑制肿瘤细胞增殖作用,表明柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黄烷酮糖苷的代谢产物可能在体内发挥抑制肿瘤活性；此外,划痕修复实验结果显示,川陈皮素和橘皮素还具有抑制人卵巢癌SKOV3(?)胞迁移的作用。 4、对瓯柑和胡柚果实四个部位提取物开展抗糖尿病活性研究,结果表明胡柚果实四个部位提取物均具有促进人肝癌细胞HepG2葡萄糖消耗的作用,而瓯柑提取物该活性不显著。进一步研究表明,胡柚果实中的柚皮苷和新橙皮苷均能促进HepG2细胞葡萄糖消耗,其效果类似降糖药二甲双胍,同时柚皮苷和新橙皮苷两者合用对葡萄糖消耗具有协同作用。Western blot结果表明,柚皮苷和新橙皮苷的降糖作用和p-AMPK蛋白激活有关。此外,柚皮素和橙皮素均能促进HepG2细胞葡萄糖消耗,且具有显著的抑制α-葡萄糖苷酶活性,表明柚皮苷,新橙皮苷等黄烷酮糖苷的代谢产物可能在体内发挥抗糖尿病活性。 本实验结果表明瓯柑和胡柚果实富含黄酮类化合物,瓯柑果实具有抑制肿瘤细胞增殖的活性,胡柚果实具有促进葡萄糖消耗的活性。