阳离子—氯离子共转运体KCC2和NKCC1在PCPA致失眠模型大鼠脑干中的表达变化

研究背景及目的 失眠是最为常见的一种睡眠障碍,是多种躯体、精神和行为疾病所具有的常见临床表现,但其确切的发生机制至今仍不明了。 对睡眠发生的相关解剖结构研究发现,觉醒与睡眠主要与脑干的网状结构有关,其有睡眠诱导功能的脑干网状抑制系统（ascendingreticular inhibitory system,ARIS）。 神经系统内阳离子-Cl-共转运体（cation-chloride cotransporters,CCCs）是一个非常重要的影响和维持Cl-浓度平衡的家族。目前报道的七种阳离子-Cl-共转运体中,神经系统内仅表达KCC1、KCC2、KCC3和NKCC1四种,其中,K+-Cl-共转运体2（K+-Cl-cotransporter 2,KCC2）负责将神经元内Cl-向外转运,而Na+,K+-2Cl-共转运体1（Na+,K+-2Cl-cotransporter1,NKCC1）则负责将胞外的Cl-向胞内转运,二者构成一对平衡体,从而维持神经元内Cl-浓度的稳定和平衡。阳离子-Cl-共转运体的功能异常,可引起中枢神经系统的Cl-的浓度异常,进而导致临床上多种神经系统疾病,如癫痫和持续性疼痛等,提示阳离子-Cl-共转运体可能通过影响GABA能神经元,在神经兴奋/抑制的平衡中扮演了重要角色,而失眠正是一种神经兴奋/抑制功能失衡导致的临床疾病。 作为经典的治疗失眠的药物,地西泮（安定）等属苯二氮卓受体激动剂,它们可通过促进GABA与GABAA受体的结合而使Cl-通道开放的频率增加,更多的Cl-内流,引起突触膜超极化,产生快抑制性突触后电位（inhibitory postsynaptic potential,IPSP）,而发挥神经抑制功能。而这个过程中,阳离子-Cl-共转运体KCC2和NKCC1会发生什么同步变化呢?目前国内外尚未见相关报道。 本研究拟采用腹腔注射PCPA制成大鼠失眠模型,并同步设立生理盐水对照组和地西泮干预组,分别检测各组大鼠脑干组织中KCC2mRNA和NKCC1 mRNA的表达变化,并检测细胞内氯离子浓度,以探讨其在失眠发病机制中的作用。 方法 1.动物分组及处理:采用清洁级成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验对象,随机分为3组,模型组:按照用量PCPA 300mg/Kg,用略碱性生理盐水（pH:7-8）溶解PCPA配制成混悬液,予以腹腔注射1ml/100g,每日1次,8:30-9:00 AM,连续2天,制作实验性失眠大鼠模型;对照组:与模型组同步对照,以生理盐水代替PCPA腹腔注射;干预组:自PCPA造模之后,按照地西泮片0.92mg/Kg的剂量,用蒸馏水溶解地西泮片配制成9.2%水溶液,予以灌胃,每日一次,9:00-9:30 AM,连续5天。 2.将各组受试动物于治疗后第6天断头处死,取大鼠脑干组织,液氮内保存。 3.RT-PCR法半定量检测大鼠脑干KCC2和NKCC1 mRNA的表达。 4.用氯离子荧光探针MQAE,结合激光共聚焦显微镜检测脑干组织细胞内Cl-浓度及变化。 结果 1.与对照组相比,模型组KCC2mRNA表达明显降低（P＜0.01）,干预组较模型组表达增加（P＜0.01）,但仍低于对照组（P＜0.01）。 2.与对照组相比,模型组NKCC1mRNA表达稍增加,但无显著性差异（P＞0.05）,干预组较对照组和模型组均降低（P＜0.01）。 3.与对照组相比,模型组细胞内氯离子浓度升高（P＜0.01）,干预组较模型组降低（P＜0.01）,但仍较对照组高,差异无显著性（P＞0.05）。 结论 1、脑干KCC2 mRNA表达下调及细胞内Cl-浓度的升高可能与失眠的发病有关。 2、地西泮可能通过上调KCC2 mRNA和下调NKCC1 mRNA的表达,以及降低细胞内Cl-浓度而发挥镇静催眠的作用。