乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)易致慢性化感染,但其慢性化机制尚不完全清楚。许多研究已经证实慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B,CHB)的发病机制与机体的细胞免疫功能低下密切相关,但CHB患者细胞免疫功能低下的机制尚未完全阐明,近年来有研究提出与淋巴细胞的激活诱导细胞死亡(activation induced cell death,AICD)有关。AICD是指已活化的成熟淋巴细胞(T或B)再次受到激活信号激活后(特别是TCR/CD3复合体)所发生的细胞凋亡,这是维持机体免疫稳定的一种生理机制,也可能是形成外周免疫耐受的重要原因。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells ,PBMC)主要由淋巴细胞组成,还包括单核巨噬细胞、自然杀伤细胞等免疫活性细胞,在机体的免疫反应特别是细胞免疫反应中起重要的作用,检测PBMC凋亡状况可大体反映外周血淋巴细胞凋亡状况。有研究发现CHB患者外周血淋巴细胞和PBMC发生AICD的比率比正常对照高,提示淋巴细胞可能在HBV特异性抗原刺激下被激活,再发生自身凋亡(即AICD),使淋巴细胞的数量减少或活性下降,从而导致CHB患者细胞免疫功能低下,这可能是导致HBV持续慢性感染的一个重要因素,也是形成HBV慢性感染免疫耐受的一个重要机制。因此如何通过调节AICD来减少淋巴细胞凋亡,改善CHB患者的细胞免疫功能,将是打破免疫耐受状态、清除慢性乙型肝炎患者体内HBV的可能途径。但是关于CHB患者PBMC发生AICD的机制尚未完全阐明,目前关于其凋亡途径的研究主要集中于由Fas/FasL等介导的死亡受体凋亡途径和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡途径,认为死亡受体途径和线粒体途径可能在CHB患者PBMC的AICD过程中起着重要的作用。
c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)家族是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)超家族成员之一,也被称为应激活化蛋白激酶(stress-activated MAP kinase,SAPK),其上游双特异性激酶MEK4/7通过双磷酸化JNK的Thr183和Tyr185位点而激活JNK,磷酸化JNK(p-JNK)是其活性形式。JNK能介导多种胞外刺激(如应激、Fas、TNFα等)诱导的细胞凋亡,参与了许多细胞凋亡的发生,在多种疾病的发生发展中起重要作用。目前认为JNK介导凋亡的机制主要是能通过转录依赖或非转录依赖的方式调控下游凋亡相关靶基因的表达或靶蛋白的活性而介导死亡受体途径及线粒体途径的细胞凋亡。c-Jun和Bim都是JNK介导的细胞凋亡信号通路中的重要下游分子。c-Jun是核内转录因子AP-1蛋白的一员,是第一个被发现的JNK核内底物,磷酸化c-Jun(p-c-Jun)是其活性形式。活化的JNK(p-JNK)转位到细胞核后能够使c-Jun第63、73位丝氨酸双磷酸化而激活,从而提高其转录活性,促进下游凋亡相关靶基因的转录和凋亡蛋白的表达(如FasL、Bim、c-myc等),分别启动死亡受体途径及线粒体途径的细胞凋亡。Bim是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员,是一种重要的凋亡调节蛋白。JNK被活化后可以从胞质转位入核通过激活转录因子c-Jun而上调Bim的表达,也可以在胞质内直接使Bim蛋白磷酸化而诱发线粒体途径的细胞凋亡。
近年来研究证明JNK信号通路参与介导了多种疾病淋巴细胞的AICD过程。Mehrotras等发现应用JNK特异性抑制剂SP600125可以对抗流感表位特异性CTL发生的AICD,说明JNK参与介导了流感表位特异性CTL的AICD过程。有研究发现JNK参与介导了小鼠脾脏T细胞的AICD过程。但是关于JNK信号通路是否也参与介导了CHB患者PBMC的AICD过程还未见报道。为此我们以CHB患者PBMC为研究对象,体外模拟AICD过程,观察JNK通路的p-JNK、总JNK及其下游转录因子p-c-jun和下游蛋白Bim的表达情况和PBMC的凋亡率,以及在JNK特异性抑制剂SP600125抑制JNK后,p-JNK、总JNK及其下游p-c-jun、Bim蛋白的表达和PBMC凋亡率的变化,来探讨JNK信号通路在CHB患者外周血单个核细胞AICD过程中的作用。
目的:
研究JNK信号通路在慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞AICD过程中的作用,进一步探讨AICD发生的机制,为慢性乙型肝炎的治疗提供理论依据。
方法:
1入选标准和排除标准
选取慢性乙型肝炎患者共40例,其中男性22例,女性18例,年龄在18岁-60岁,平均年龄35岁。随机分为两组,慢性乙肝组20例,慢性乙肝+抑制剂组20例。所有病例诊断标准均符合2005年中华医学会制定的“慢性乙型肝炎防治指南”, HBVDNA大于1×103copies/ml小于1×107copies/ml,ALT两倍以上升高。排除应用过抗病毒药物的患者,排除HAV、HCV、HDV、HEV和HIV感染,排除近3个月应用糖皮质激素、干扰素等影响免疫功能药物的患者,除外有近期急性感染患者。健康对照组20例,男12例,女8例,年龄在18岁-45岁,平均年龄30岁,取自健康献血员。
2 PBMC的提取和培养
无菌条件下抽取肝素抗凝血4mL,应用密度梯度离心法分离PBMC。分离成功的PBMC加入植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)100μg/ml刺激培养16-18小时,弃去PHA,加入外源性IL-2 1000U/L进行培养至少7天后,用抗CD3抗体500ug/ml重新刺激48小时。慢性乙肝+抑制剂组在加抗CD3抗体前用JNK特异性抑制剂SP600125 20μmol/l预处理2小时。
3细胞凋亡的检测
培养的细胞用70%乙醇固定,4℃离心去掉固定液,并用冷PBS洗2次,加入含有RaseA的PI染液约1000μL,室温静置30分钟后上流式细胞仪检测凋亡率。
4 p-JNK、总JNK、p-c-jun、Bim蛋白的检测:
剩余细胞,提取蛋白后,-80℃保存,待收集够标本后集中行Western blot检测p-JNK、总JNK、p-c-jun、Bim蛋白的表达情况。
结果:
1经抗CD3抗体刺激48h后,慢性乙肝组PBMC凋亡率(28.27%±4.61%)高于健康对照组(19.36%±5.90%),差异有统计学意义(P<0.05),也高于慢性乙肝+抑制剂组(23.37%±5.52%),差异有统计学意义(P<0.05)。慢性乙肝+抑制剂组PBMC凋亡率(23.37%±5.52%)高于健康对照组(19.36%±5.90%),差异有统计学意义(P<0.05)。
2慢性乙肝组PBMC中p-JNK蛋白的表达量高于健康对照组(1.09±0.16 vs 0.83±0.12,t=5.885,P<0.01),也高于慢性乙肝+抑制剂组(1.09±0.16 vs 0.53±0.15,t=11.502,P<0.01),差异有统计学意义。总JNK蛋白在三个组的表达差异无统计学意义。慢性乙肝组PBMC中p-c-jun蛋白的表达量高于健康对照组(1.21±0.15 vs 0.96±0.13,t=5.477,P<0.01),也高于慢性乙肝+抑制剂组(1.21±0.15 vs 0.62±0.14,t=12.899,P<0.01),差异有统计学意义。慢性乙肝组PBMC中Bim蛋白的表达量高于健康对照组(0.96±0.14 vs 0.58±0.12,t=9.133,P<0.01),也高于慢性乙肝+抑制剂组(0.96±0.14 vs 0.52±0.13,t=10.086,P<0.01),差异有统计学意义。
3慢性乙肝组PBMC凋亡率与PBMC中p-JNK蛋白的表达成正相关(r=0.823,P<0.01)。
结论:
1慢性乙型肝炎患者PBMC存在AICD现象,且凋亡率较正常人高。
2慢性乙型肝炎患者PBMC中存在JNK信号通路的过度激活。
3慢性乙型肝炎患者PBMC凋亡率与PBMC中p-JNK蛋白的表达呈正相关,JNK特异性抑制剂SP600125可明显降低p-JNK、p-c-jun、Bim蛋白的表达,下调PBMC凋亡率。提示JNK信号通路参与介导了慢性乙型肝炎患者PBMC的AICD过程,是其凋亡增多的机制之一。
