OMT对模拟高原缺氧大鼠脑线粒体呼吸氧耗与能量生成的影响及抗缺氧效应研究

目的 机体各组织和器官因缺氧而受到不同程度的损伤和功能低下，这是机体初次暴露在高原低氧环境下面临的主要威胁，降低高原病的发生和提高机体在高原的生存及劳动能力是高原医学的重要课题。线粒体作为机体用氧的主要场所，其功能损害在缺氧性疾病的病理生理发展中起到关键作用，而氧化磷酸化脱偶联引起的用氧效率降低和能量生成减少是线粒体功能受损的主要特征。脱偶联蛋白（Uncoupling Proteins，UCPS）所介导的质子漏是导致氧化磷酸化脱偶联的重要机制。高原缺氧时线粒体UCPs活性和表达增加，脱偶联程度增强，线粒体膜电位降低，ATP生成减少，从而导致机体功能和代谢障碍。中医药学博大精深，中药具有广泛应用和开发前景，许多中药已广泛应用于临床。中药单体结构明确，成份单一，效果对应，是理想的实验室研究对象。氧化苦参碱（Oxymatrane, OMT）是中草药苦参中提取的有效生物碱，具有多种药理作用。本实验利用中药（单体）体外干预缺氧大鼠脑线粒体氧化磷酸化，从十余种中药（单体）中初步筛选出3种具有降低缺氧大鼠脑线粒体脱偶联、改善呼吸氧耗的药物，进一步重点观察了OMT在体外对缺氧大鼠脑线粒体能量生成及UCPs在其中的作用，在此基础上进而探讨了OMT在体内对小鼠的抗缺氧效应，为高原病的防治和提高机体在高原的生存和劳动能力提供实验依据。 方法 1.健康雄性SD大鼠随机分为平原对照组和高原缺氧组，后者暴露于模拟海拔5000米高原低压舱内，23h/d，持续3d。分别在平原和模拟高原低压舱断头处死，分离大鼠脑线粒体。用不同浓度的12种中药（单体）体外干预线粒体后，Clark氧电极法测定线粒体氧化呼吸活性，Rhodamine123法测定线粒体膜电位，初步筛选影响缺氧大鼠脑线粒体氧化呼吸的中药（单体）。 2.大鼠随机分为正常对照组，正常干预组，缺氧对照组和缺氧干预组。分别建立脑组织及离体脑线粒体体外干预模型，经2mmol/LOMT分别干预1h和5min，进一步观察OMT对缺氧大鼠脑线粒体氧化磷酸化的影响及UCPs在其中的作用。Clark氧电极法测定线粒体氧化呼吸活性，Rhodamine123法测定线粒体膜电位，高压液相色谱法分析脑组织线粒体内腺苷酸含量，[3H]-GTP结合法测定脑组织UCPs的活性，实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别测定UCP4、UCP5mRNA和蛋白表达。 3.健康雄性昆明小鼠，利用常压密闭缺氧模型，通过腹腔注射不同剂量的OMT或人参皂苷Rg1，观察标准耐受时间，探讨其抗缺氧能力及其量效和时效关系。 结果 1.通过对12种中药（单体）成份作用的观察发现，OMT和人参皂苷Rg1均能通过降低缺氧大鼠脑线粒体ST4来提高氧化磷酸化效率，同时增加线粒体膜电位，且具有量效关系，1.5mmol/L的OMT和人参皂苷Rg1分别能使缺氧大鼠脑线粒体RCR升高33.04%和34.25%，线粒体膜电位分别增加18.13%和16.15%（2mmol/L）。 2.与正常对照组比较，缺氧对照组大鼠脑线粒体UCPs活性和含量明显升高，Kd值降低40.39%，Bmax提高105.26%，同时脑组织中UCP4和UCP5的mRNA和蛋白质表达也明显升高，其中UCP4和UCP5的mRNA量分别升高2.87倍和2.54倍，而蛋白表达量分别提高70.13%和116.67%；与缺氧对照组相比，缺氧干预组脑线粒体kd提高44.08%，Bmax值降低20.90%，UCP4和UCP5mRNA分别降低至0.46和0.48，且UCP4和UCP5蛋白表达也显著降低（34.35%和55.77%）。 3.与正常对照组比较，缺氧对照组大鼠脑线粒体ST3、RCR和MMP显著降低（分别降低18.44%、42.06%和18.78%），而ST4则显著升高（40.38%）；与缺氧对照组相比，2mmol/L OMT体外干预可显著改善线粒体氧化磷酸化效能，主要表现为ST4降低26.03%，RCR与MMP分别提高47.10%和18.13%。 4.与正常对照组比较，缺氧对照组大鼠脑线粒体ATP含量、ATP/ADP、能荷和ATP/总腺苷酸比值显著降低，AMP和ADP含量显著上升，其中ATP含量、ATP+ADP池、ATP/ADP、能荷以及ATP/总腺苷酸比值分别降低37.80%，24.59%，48.34%，29.79%和39.02%，AMP和ADP分别提高29.51%和18.51%；与缺氧对照组相比，2mmol/LOMT体外干预可显著升高ATP含量、ATP/ADP、能荷和ATP/总腺苷酸比值，降低ADP含量，其中ATP、ATP/ADP、能荷和ATP/总腺苷酸比值分别升高30.63%、120.47%，18.18%和36.00%，ADP降低40.56%。 5.腹腔注射OMT可显著延长小鼠在密闭缺氧条件下的存活时间，且存在量效依赖关系。在最佳干预剂量（0.3g/kg）时，OMT可提高小鼠标准耐受时间185.68%（13.83±3.17vs39.51±9.03min/100mL），注射1小时即可发挥最佳效果。 结论 1.利用离体脑线粒体体外干预模型，从十余种中药单体成份中初步筛选出OMT、人参皂苷Rg1和红花黄色素可改善缺氧大鼠脑线粒体的氧化磷酸化效率，其中OMT和人参皂苷Rg1还可提高缺氧大鼠脑线粒体膜电位。 2.OMT体外作用可显著抑制缺氧引起的脑线粒体脱偶联效应，增加线粒体ATP生成，从而提高线粒体能量生成效率。其机制与OMT显著抑制缺氧引起的脑线粒体UCPs活性增加和表达增强有关，提示UCPs为OMT的作用靶点之一。 3.OMT可显著增加密闭缺氧小鼠的存活时间（约2.8倍），且有量效依赖性。表明OMT具有显著提高整体小鼠抗缺氧能力的作用。