目的：核因子-κB (nuclear transcription factor-kappa B, NF-κB)作为一种广泛存在体内细胞的核转录调节因子,参与免疫、炎症及细胞增殖的调控。近年来研究认为抑制NF-κB信号传导、诱导HSCs凋亡,是治疗肝纤维化的一条重要途径。本研究基于NF-κB信号通路的调节,旨在研究满天星异荭草苷(2"-O-a-L-阿拉伯糖异荭草苷,IOA)对肝星状细胞增殖、凋亡的调控作用,探讨其体外抗肝纤维化的作用机制。方法：本研究采用的肝星状细胞包括HSC-T6、LX2和7702。细胞分为6组：正常组,IL-1β刺激组,阳性药组(PDTC组),异荭草苷低、中、高剂量组(IOAL、IOAM、和 IOAH组)。采用MTT法、集落生成法、划痕实验、Annexin V-FITC/PI和AO-EB染色分别检测细胞增殖、集落形成、迁移、凋亡及细胞周期；酶联免疫吸附测定法(ELISA法)检测细胞上清Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)和转化生长因子-β1 (TGF-β1)的含量；免疫组化法测细胞核转录因子-κBp65 (NF-κB p65)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、 Ⅲ型胶原(Col-Ⅲ)的表达；RT-PCR法检测I型胶原(Col-I)、 Col-Ⅲ、NF-κB p65、核因子κB抑制蛋白α亚基(IκKBα)、TGF-β1和 TNF-α mRNA的表达；Western blot法检测磷酸化NF-κB p65 (p-p65)、NF-κB p50、 IκBα、Col-I、NF-κB核转位及细胞浆磷酸化IκBα(p-IκBα)、细胞核NF-κB p65的表达。结果：(1)IOA对细胞增殖、集落形成、迁移、凋亡及细胞周期的影响实验发现,IOA对细胞增殖有抑制作用,呈浓度依赖性(P<0.05或P<0.01)。与正常组相比,IL-1p刺激组细胞增殖明显增加(P<0.01),细胞迁移及集落生成明显加快、增多,细胞凋亡率、细胞形态学和细胞周期无明显改变；经药物干预后,PDTC与IOAL、IOAM、IOAH均能显著抑制HSCs增殖、迁移及集落的生成,提高细胞凋亡率,诱导细胞阻滞在G2期,引起细胞形态学发生明显变化(P<0.05或P<0.01)。这些结果表明,IOA能明显抑制肝星状细胞的增殖、迁移,促进其凋亡,从细胞水平上证实了IOA抗肝纤维化的机制与抑制肝星状细胞的增殖活化有关,为其靶向治疗肝纤维化提供了实验依据。(2)IOA对胶原的影响RT-PCR研究结果显示,与正常组相比,IL-1p可明显上调HSC-T6、LX2细胞Col-I和Col-Ⅲ mRNA的表达(P<0.01); ELISA试剂盒、免疫组化结果显示,与正常组相比,IL-1p刺激组细胞Col-Ⅲ合成和分泌明显增多(P<0.05或P<0.01); Western blot研究结果显示,与正常组相比,IL-1β刺激组Col-Ⅰ的表达显著提高(P<0.05或P<0.01)。经药物干预后,PDTC和IOAL、IOAM、IOAH均能显著下调Col-Ⅰ和Col-Ⅲ mRNA和蛋白的表达,抑制Col-Ⅲ合成和分泌,降低Col-Ⅰ含量(P<0.05或P<0.01)。提示,IOA能明显抑制肝星状细胞胶原的合成与沉积,抑制ECM生成,是其抗肝纤维化发生发展的药理学基础。(3)IOA对炎症因子的抑制作用ELISA试剂盒检测和实时荧光定量PCR检测结果表明,IL-1p可显著上调HSC-T6和LX2细胞TNF-α、TGF-β1的含量和mRNA的表达(P<0.01)。经药物干预后,PDTC与IOA均能显著降低TNF-α、TGF-β1的含量,显著下调HSC-T6细胞TNF-α、TGF-β1 mRNA的表达(P<0.05或P<0.01)。结果表明,IOA能显著抑制肝星状细胞炎症因子的释放,减轻炎症损伤,是其改善肝纤维化的作用机制之一。(4)IOA对基质金属蛋白酶(MMP-9)的影响免疫组化结果发现,与正常组比较,IL-1p刺激组HSC-T6、LX2细胞MMP-9蛋白表达明显提高(P<0.01)。经药物干预后,PDTC与IOAM、 IOAH均能显著降低MMP-9蛋白表达(P<0.05或P<0.01)。这些数据提示,IOA抑制肝星状细胞胶原的生成与其降低MMP-9的活性有关。(5)IOA对NF-κB信号通路的影响实时荧光定量PCR检测结果显示,PDTC与IOA均能显著下调HSC-T6、LX2细胞NF-κB P65 mRNA的表达,并上调IκBα mRNA的表达(p<0.01)o Western Blot结果显示,IL-1p刺激组细胞p-p65、NF-κB p50、细胞浆P-IκBα、细胞核NF-κB p65蛋白表达明显增加(P<0.01),细胞浆NF-κB p65和IκBα表达明显减低(P<0.05或P<0.01)。经药物干预后,上述情况得到逆转。免疫细胞化学染色显示细胞核内NF-κB p65阳性染色细胞增多浓染,提示IL-1p可以诱导NF-κB活化；经药物干预后,PDTC与IOA细胞核内NF-κB p65阳性染色细胞数减少淡染,核转位减少表明IOA可减少细胞核NF-κB p65表达,阻止NF-KB核转位,从而抑制NF-κB活化,对NF-κB信号传导通路有明显的抑制作用。结论：IOA能抑制IL-1β诱导的增殖,阻滞细胞于G2期,诱导细胞凋亡,减少胶原的合成和分泌,降低炎症细胞因子的释放；IOA可调控基质金属蛋白酶的水平,抑制IκBa磷酸化、细胞核NF-κBp65表达和NF-κB核转位。这些结果表明,IOA能明显抑制肝星状细胞的活化和增殖,其机制可能与抑制NF-rB信号通路有关。
