菌株DyellaginsengisoliLA-4降解联苯及基因的克隆与表达

本论文旨在考察1株新分离的Dyella属菌株LA-4对联苯的降解特性并对其代谢基因进行分子遗传学研究。对菌株LA-4进行生理生化、Biolog分析及16S rDNA分子鉴定,考察其生长及降解联苯的特性,推测出菌株LA-4降解联苯的途径;将该菌株作为生物强化制剂进行生物强化降解联苯的研究,采用PCR-DGGE分子指纹技术对强化体系进行微生物群落动态解析;利用染色体步移法扩增得到完整的bph基因簇,并对其中的bphA1A2、bphA3、bphA4、bphB、bphC和mfphA基因进行克隆和表达。 菌株LA-4是一株新的联苯降解菌,结合生理生化鉴定、菌株的形态观察、Biolog鉴定及16S rDNA序列分析,菌株LA-4归属于变形细菌Y亚类,Dyella属ginsengisoli菌种。菌株LA-4已作为专利菌种保存于中国普通微生物菌种保藏中心,注册编号为:CGMCC No.2723。菌株LA-4与Dyella ginsengisoli Gsoil 3046T（=DSM 18387T）的16SrDNA序列相似性高达98.22%,其16S rDNA序列登录GenBank,注册号为:EF191354。 菌株LA-4对卡那霉素和链霉素具有抗性,对其它所试抗生素均无抗性。菌株LA-4的最适生长与降解条件为30℃,pH=6.0,摇床转速为150 r/min。加入的表面活性剂Tween-80浓度小于40 mg/L时会促进菌株LA-4对联苯的降解;菌株在生长降解过程中可以耐受3%的盐度;菌株具有抗金属离子Zn2+的能力。菌株LA-4的粗酶具有2,3-二羟基联苯1,2-双加氧酶活性,且为组成酶。联苯在菌株LA-4的作用下,有黄色中间产物产生,苯环发生了间位断裂反应。LC-MS分析中检测到主要降解中间产物为2-羟基-6-氧-6-苯基己二烯酸（HOPDA）和苯甲酸。 将菌株LA-4的游离态细胞投加到联苯处理系统中进行生物强化降解研究,结果表明投加菌株LA-4的游离态细胞可以缩短处理系统的启动时间,投加不同接种量对强化效果有显著影响,投配比为3.96%的系统显示出最强的处理效果,在进水联苯浓度为500-1000 mg/L时,处理效果稳定。利用PCR-DGGE对强化体系进行微生物群落动态解析,结果表明活性污泥体系和投配比为1.98%的系统随着体系的不断运行,微生物的多样性逐渐降低;当进水联苯浓度逐渐升高时,投配比为1.98%的系统中,强化菌逐渐消失。而在投配比为3.96%的系统中可证明体系中始终有强化菌LA-4的存活。 利用染色体步移的方法从菌株LA-4的基因组DNA中扩增得到完整的bph基因簇,全长为12,186 bp,全序列登录GenBank,序列号为EU258607。对整个基因簇进行解析,结果表明基因排列顺序为bphA1A2-ORF1-bphA3A4BCXOX1-ORF2-bphX2X3D,其中12个基因出现在已报道的bph基因簇中,ORF2基因首次在bph基因簇中发现,位于6phX1和bphX2基因之间。根据基因排列特点,说明其属于LB400型bph基因簇。ORF2基因与菌株Pseudomonas putida UCC22（BAB62053）中编码2-羟基粘康酸半醛水解酶（2-hydroxymuconic semialdehyde hydrolase）的基因相似性最高,确定其为编码芳环间位断裂产物水解酶的基因,命名为mfphA。菌株LA-4中的联苯降解酶与其他已知的相应酶的氨基酸序列相似性较低,最高相似性均在63-89%之间。 将bphA1A2、bphA3、bphA4、bphB和bphC基因在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达。菌株LA-4联苯双加氧酶(BPDOLA-4)基因的表达产物能够转化联苯/多氯联苯等物质,以联苯为底物时,酶的比活性最高,为134.9 nmol NADH/min（mg protein）。BPDOLA-4对底物的选择性按以下顺序:联苯＞4-氯联苯＞2,5-二氯联苯＞2,2′-二氯联苯＞2,5,2′-三氯联苯＞3,3′-二氯联苯＞2,5,3′-三氯联苯＞4,4′-二氯联苯＞2,5,4′-三氯联苯。实验中未检测到联苯双加氧酶转化2,2′,5,5′-四氯联苯的活性。实验表明BPDOLA-4还具有转化二苯并呋喃和黄烷酮的活性。通过GC-MS和紫外可见光谱分析确定了菌株LA-4的联苯双加氧酶在转化联苯及多氯联苯时仅存在2,3-位双加氧活性,而未发现其具有3,4-位加氧活性。 通过对BphC LA-4的氨基酸序列分析,说明BphC LA-4为双域的Ⅰ类Fe（Ⅱ）依赖型外二醇双加氧酶。利用A|¨KTA蛋白质层析仪对bphC基因在大肠杆菌中的表达产物进行纯化。纯化后的BphC LA-4可以催化邻苯二酚类物质的间位开环反应,以2,3-二羟基联苯为底物时,酶的比活最高,为118.3 U/mg,酶反应的最适pH为8.0,最佳温度为40℃。BphCLA-4对催化底物的选择性按以下顺序:2,3-二羟基联苯＞3-甲基邻苯二酚＞邻苯二酚＞4-氯邻苯二酚＞4-甲基邻苯二酚。 根据MfphA的氨基酸序列分析和三级结构模拟的结果,说明mfphA基因所编码的酶属于α/β水解酶家族,可以在单环芳香化合物降解过程中水解芳环间位开环产物。将mfphA基因在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,并利用A|¨KTA蛋白质层析仪对表达产物进行了纯化。纯化后的MfphA可以水解单环芳香化合物间位断裂产物,以2-羟基-6-氧-2,4-己二烯酸（HODA）为底物时酶的比活性最高,为2.0 U/mg;酶反应的最适pH为7.0,最佳温度为70℃,可以长期于低温下保存。MfphA对催化底物的选择性按以下顺序:6-methyl-HODA＞HODA＞5-methyl-HODA＞6-phenyl-HODA＞5-chloro-HODA。