半枝莲黄酮类化合物抑制肿瘤细胞转移与基底膜黏附的实验研究

多种肿瘤的生长、转移、复发和预后均与肿瘤血管生成密切相关,这个复杂的多步骤过程中包括黏附、基质降解与移动[1] ,抑制其中任何一个过程理论上均可抑制肿瘤的侵袭转移。因此,以肿瘤血管生成为靶点,开发血管生成抑制剂在抗肿瘤研究中是一个新的十分活跃的研究领域。目前大约发现了300多种具有血管生成抑制活性的化合物其中超过30个进入临床Ⅰ到Ⅲ期研究,但是目前临床试验的结果表明很多药物在抑制血管生成的同时带来了不可抵抗的毒副作用,因此人们逐渐将目光转向了天然药物的研究。祖国医学中中药具有取材简便,毒副作用少的特点,因此以天然药物为研究对象,来探讨和研究新型的抗肿瘤药物已逐渐成为当今热点。本试验旨在研究并证明传统中药半枝莲活性成分的抗肿瘤活性,继之课题组的前期研究结果,从血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶-2以及整合素ανβ3等角度探讨半枝莲活性成分的抗肿瘤作用机制,为进一步开发高效低毒的抗肿瘤药物奠定理论基础。 我们采用系统溶剂分离法、硅胶柱层析法等方法,获得半枝莲不同极性的提取物以MTT比色试验及流式细胞术等技术为手段,从中筛选出抑制内皮细胞及肿瘤细胞增殖作用最强的成分。采用免疫荧光术、ELISA等方法,进一步研究其抑制肿瘤生长、侵袭和转移的作用及其机理。实验结果如下: 1.半枝莲黄酮类化合物的提取与分离:硅胶柱层析法以氯仿-甲醇混合溶剂梯度洗脱(10:0; 100:1; 100:4;100:8;100:20;100:50;0:1),收集洗脱液,由硅胶薄层(TLC)检识,合并相同流份,共得7个极性部位(A、B、C、D、E、F、G)。 2.半枝莲抑制内皮细胞及肿瘤细胞增殖有效成分的筛选:各部位经MTT法检测活性,最后得活性强的部位。活性最强的半枝莲黄酮类化合物不同浓度(20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml)与空白对照组比较能有效抑制ECV-304细胞系、SGC-7901细胞系以及B16-BL6细胞系的增殖。 3.半枝莲黄酮类化合物能诱导胃癌细胞的凋亡:取30μg/ml、60μg/ml、120μg/ml、240μg/ml四个浓度梯度,随浓度增加细胞凋亡率也增加,但30μg/ml组与空白组比较没有显著差异,当浓度达到120μg/ml时,胃癌细胞凋亡增加,与空白对照组比较有显著差异(P<0.01)。 4.半枝莲黄酮类化合物能抑制ECV-304细胞系和B16BL6细胞系对基底膜黏附能力:作用B16BL6细胞60min后高剂量组(40μg/ml)与对照组之间统计有显著差异(p<0.01),作用120min后中高剂量组(20μg/ml、40μg/ml)与对照组比较有显著统计学差异(p<0.01),各剂量组从低到高其粘附率呈递减趋势;作用后的ECV-304对基底膜的黏附率在60min与对照组比较无差异,作用120min后浓度达到40μg/ml时其对基底膜的黏附率与对照组比较有差异(P<0.01)。 5.半枝莲黄酮类化合物能抑制ECV-304细胞系与B16-BL6细胞系之间黏附能力:半枝莲黄酮类化合物作用120min后B16-BL6细胞系对内皮细胞的黏附能力显著下降,与空白组比较有显著差异(P<0.01)。 6.半枝莲黄酮类化合物能抑制SGC-7901细胞VEGF、MMP-2的表达:同一时间段与空白对照组相比,半枝莲黄酮类化合物各浓度作用细胞24、48h后均能明显抑制肿瘤细胞的VEGF表达,具有显著差异(p<0.01)。半枝莲黄酮类化合物作用细胞48h后中、高浓度组(40μg/ml、80μg/ml)能抑制肿瘤细胞MMP-2的表达,与对照组比较有显著差异(p<0.01)。同一浓度体系,24h与48h相比在中、高浓度时对VEGF表达影响具有差异性(P<0.01),高浓度时对MMP-2表达影响具有差异性(P<0.01),其他浓度相比没有显著差异。 结论:半枝莲黄酮类化合物C在体外具有抑制VEGF及MMP-2表达的作用,并抑制内皮细胞和肿瘤细胞对基底膜的黏附能力,其机理可能通过抑制肿瘤细胞黏附分子和其他促血管生成相关因子的表达,诱导肿瘤细胞及内皮细胞凋亡、抑制内皮细胞及肿瘤细胞的增殖从而阻断肿瘤血管生成,抑制肿瘤的远处转移及侵袭。