RNA结合蛋白QKI在结肠癌演变中的表达变化及其功能研究

结肠肿瘤全球高发,每年新增病例100万,其中50%发现即为晚期,治疗困难,死亡率高。虽然结肠肿瘤演变过程中Wnt通路异常、RAS/RAF突变、p53突变、TGFβ通路异常等重要分子事件序贯发生的整体框架已经基本建立,但是结肠肿瘤治疗尚未发生根本性变化。这一问题的关键在于,第一,肿瘤早期诊断缺乏明确的标志物;第二,肿瘤演变中仍有相当数量的重要分子事件没有阐明。进一步阐明结肠癌演变过程中重要的分子改变,特别是结肠癌演变过程中早期的分子事件,对结肠癌的防治至关重要。 转录后调控作为基因表达的重要调控方式,参与系统发生和疾病演变等重要生理和病理过程的调控。而传统的基于基因表达芯片的高通量方法主要检测的是RNA水平的变化,而对机体通过转录后调控方式只影响蛋白水平、而不改变RNA水平的表达变化几乎无能为力;此时,传统的对单个基因进行鉴定的研究就显得尤为重要和必要。 RNA结合蛋白QKI属于STAR家族,由于其上游调控区的部分缺失引起少突胶质细胞特异性的QKI表达降低导致神经髓鞘形成障碍,小鼠出现严重震颤表型,故得名QKI(quaking)。QKI自身存在多种异构体,其中QKI-5主要表达于胚胎时期,定位于细胞核;而QKI-6和QKI-7主要定位于细胞浆。QKI通过识别并结合于mRNA 3’UTR上QKI反应元件(QRE,主要是含有NACUAAY-N(1-20)-UAAY的序列特征),来调节靶mRNA在细胞内的定位、稳定性以及翻译效率等,参与机体生理和病理过程的调控,如:QKI通过增强MBP、p27的表达、促进MAG的可变剪接,调控髓鞘的形成。生物信息学显示QKI能够调节众多与细胞增殖和分化相关的靶基因,可能扮演抑癌基因的功能。 【目的】 ①探讨QKI在结肠上皮分化过程中的表达规律,初步建立QKI的表达与细胞增殖和分化的关系; ②分析结肠癌中QKI的表达变化,探讨QKI在结肠肿瘤中表达异常的机制; ③探讨QKI对结肠癌细胞增殖和分化的影响; ④阐明QKI调节结肠癌细胞增殖和分化的主要分子机制,特别是该过程中QKI下游靶分子的筛选和鉴定。 【方法和结果】 ①首先比较了RNA结合蛋白QKI在结肠上皮分化过程中(自crypt至villi)的表达变化,免疫组化结果显示QKI在crypt就有表达,随着细胞分化,QKI整体表达没有明显变化;对结肠上皮自crypt至villi进行不同分化程度的细胞进行分离,发现crypt处细胞表达的QKI主要为QKI-5,而处于villi的细胞则既表达QKI-5又表达QKI-6;表明在结肠上皮分化过程中,QKI异构体表达存在动态变化;体外诱导HT29细胞分化,发现而随着细胞的分化,QKI-5则早期表达增加,后逐渐降低,而QKI-6则逐渐增加; ②通过比较QKI在正常结肠上皮和结肠癌中的表达差异,发现QKI-5、QKI-6两种异构体在正常结肠上皮表达较高;而结肠癌细胞系(HT29, SW480, SW620, HCT116, Colo205)和临床肿瘤样本中QKI表达普遍有所降低,部分结肠癌细胞QKI表达甚至缺失; ③进一步分析发现,QKI启动子富含CpG岛,肿瘤样本中QKI启动子甲基化程度与正常细胞相比明显增高,与基因表达量呈负相关,甲基化酶抑制剂5aza-dC可以部分恢复Colo205细胞中QKI的表达,表明启动子甲基化是QKI在结肠肿瘤中表达降低的主要原因; ④在结肠癌细胞系HT29过表达QKI-5和QKI-6均可以促进细胞分化标志碱性磷酸酶和乳糖酶的表达;相反RNAi干涉QKI则降低了碱性磷酸酶和乳糖酶的表达,表明在肿瘤细胞系QKI-5和QKI-6均可以促进细胞分化; ⑤流式细胞仪检测QKI过表达可以显著促进细胞撤血清后同步化至G1的效率,延长G1期时长,这可能为细胞分化提供了时间保证; ⑥与促进细胞分化相对应,MTT实验和软琼脂克隆形成实验则证实QKI-5和QKI-6两种异构体在抑制细胞增殖和克隆形成方面稍有差异,过表达QKI-5微弱抑制细胞增殖和软琼脂克隆形成,而过表达QKI-6则能显著抑制细胞的增殖和软琼脂克隆形成的数量和大小; ⑦为了分析QKI调节结肠上皮分化发育和结肠癌演变的具体机制,我们着重探讨了QKI对该过程中重要基因p27和β-catenin的可能调控作用,结果发现,与文献报道的一致,QKI-6在结肠癌细胞同样可以促进p27表达,此外,QKI-5同样能够增强p27 mRNA稳定性、促进p27表达,但QKI-5这种调控只发生在细胞过密生长的条件下,这一结果进一步提示QKI这一STAR(signal transduction and activation of RNA)家族成员对靶基因的调节很可能受细胞信号转导的调节; ⑧过表达QKI-5和QKI-6均可以增强内源β-catenin的细胞膜水平、降低其在细胞浆和细胞核的分布,进而抑制β-catenin的转录活性,采用β-catenin的mRNA3’UTR报告系统和RNA的免疫共沉淀实验确认了QKI与β-catenin存在相互作用,并找到QKI作用的元件,提示QKI在β-catenin等mRNA的定向转运和局部翻译过程中可能扮演重要作用。 【结论】 通过本课题的研究,我们首次发现QKI异构体在结肠上皮分化过程中动态变化,初步阐明了QKI在结肠癌中表达降低的机制,明确了其作为潜在的抑癌基因对分化和增殖相关基因p27和β-catenin的调控机制,为进一步认识其表达降低参与结肠癌演变的机制奠定了基础。