生长因子基因在损伤兔关节软骨细胞中的表达

目的:分离、培养及鉴定体外兔膝关节软骨细胞；建立软骨细胞培养方法并获得足量稳定的软骨细胞；建立体外兔关节软骨细胞损伤模型；通过实时荧光PCR技术，分析损伤后不同时间点的生长因子表达。 方法:1.取4周龄健康新西兰兔膝关节软骨，以机械分离和酶阶段消化分离相结合的方法获取膝关节软骨细胞；体外培养、传代，观察不同培养阶段细胞形态、生长；CCK-8法测定增殖，绘制生长曲线；行甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定软骨细胞。2.软骨细胞体外培养传代，将生长状态良好的第三代关节软骨细胞接种于六孔板内并划伤，建立体外培养关节软骨细胞划伤模型。3.显微镜下观察软骨细胞在划伤前后的形态变化；通过实时荧光定量PCR技术检测划伤前和划伤后1，3，7天四个时间点的血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、胰岛素样生长因子-Ⅰ（insulin-like growthfactor，IGF-1）和Ⅱ型胶原（collagenⅡ）基因mRNA表达。 结果:1.兔软骨软骨经两步消化，可获取高纯度的软骨细胞，细胞活性率可达95%以上，甲苯胺蓝染色及免疫荧光呈阳性结果。原代细胞和第一代细胞呈多角形，传代4～5代后，细胞形态逐渐由多角形变为梭形，基质分泌氨基多糖(GAGs)和胶原染色变浅。2.成功建立软骨细胞体外培养划伤模型，细胞划伤后划痕两侧边缘整齐，随着培养时间推移，细胞伸出突起并向划痕区延伸，划痕区开始出现软骨细胞，并相互间发生融合。3.在细胞划伤模型中，细胞划伤后VEGF和bFGF基因都呈明显低水平表达。而TGF-β1、IGF-Ⅰ和Ⅱ型胶原基因却呈现较高表达水平。VEGF基因在细胞损伤第3天的表达高峰后开始回落，而bFGF、TGF-β1及Ⅱ型胶原基因在损伤的第1天表达明显降低（P<0.05），随后呈现升高的趋势。IGF-Ⅰ基因在损伤初期表达变化平稳，在损伤第3天后出现明显升高趋势(P<0.05)。 结论:成功建立了简单宜行的软骨细胞分离、培养方法，通过传代获取大量实验细胞，但仅限于五代以内适用于组织工程研究之用；成功在体外培养兔膝关节软骨细胞并建立划伤模型；在损伤模型中bFGF、TGF-β1、VEGF、IGF-Ⅰ和Ⅱ型胶原基因表达水平存在差异性，这为选择合适的基因治疗软骨损伤提供重要的分子生物学基础。