黄连解毒汤对高脂血症小鼠肠道微生态的影响

目的 黄连解毒汤为唐代王焘所著《外台秘要》中所收载的一首名方,由黄连、黄柏、黄芩、栀子组成。功能清热燥湿、泻火解毒,主治三焦火毒热盛证,症见身大热,烦躁不安,神昏谵语；或外科疮痈疔疖具有红肿热痛者。近年来的研究表明,黄连解毒汤及其配伍成分在心血管疾病的防治中起着越来越重要的作用,黄连解毒汤具有降血糖、纠正脂质代谢紊乱、改善胰岛素抵抗等作用。在临床上已用于高血压、心绞痛的治疗。而也有研究表明肠道菌群与脂肪代谢具有密切的关系[6-8]。但人类共生微生物与高脂血症的关系的研究较少,且未见肠道微生物的基因组与高脂血症关系的报道。本实验主要通过荧光定量PCR以及PCR-变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE）,借助广谱抗生素,探讨高脂饮食诱导高脂血症小鼠肠道菌群的特点。同时选用清热解毒方黄连解毒汤,研究用药之后高脂血症小鼠肠道菌群的变化,探讨黄连解毒汤对高脂血症小鼠肠道微生态的影响。通过本次实验探讨黄连解毒汤抗高脂血症的作用机制。 方法 本实验研究主要包括以下内容： 1.C57BL/6小鼠用高脂饮食喂养建立高脂血症动物模型 1.1高脂血症动物模型建立方法如下： 60只C57BL/6雄性小鼠,17-20g。随机分为6组,分别为常规饲料组,高脂饲料组,常规饲料加抗生素组,高脂饲料加抗生素组,中药低剂量组及中药高剂量组。抗生素组为：1g/L氨苄青霉素+500mg/L盐酸万古霉素+1g/L灭滴灵+1g/L硫酸新霉素,放在饮水中让小鼠自由饮用。中药组为黄连、栀子、黄芩、黄柏水煎液,高剂量（18g：18g：12g：12g）为390mg生药/mL,低剂量（9g：9g：6g：6g）为195mg生药/mL,根据《中药药理研究方法学》实验动物与人按体表面积比等效剂量换算表换算所得。中药高低剂量组每只动物每日灌胃0.4mL,连续灌胃28d。除常规饲料组及常规饲料加抗生素组外其余四组均给予高脂饲料。实验过程中高脂饲料组、常规饲料加抗生素组、中药高剂量组各死亡一只。 1.2动物用药28d后,摘眼球取血,分离血清,采用酶法分析检测动物血清总胆固醇,其余样品放于无菌1.5m1离心管内-80℃冻存；将小鼠处死后,无菌操作剖取回盲部粪便,-20℃保存备用。 2.药物治疗后各组小鼠前后体重的变化 在用药前称取各组小鼠体重,计算平均值与标准差,用药结束后在再称取计算其均值与标准差,对比各组小鼠治疗前后体重的变化。 3.药物治疗对各组小鼠血糖及血清总胆固醇的影响 用血糖仪（长沙三诺生物传感技术股份有限公司产品）检测各小鼠血糖,血糖试纸为该公司安稳型。用总胆固醇试剂盒-CHO（酶法）检测小鼠血清总胆固醇。因本课题组前期实验发现血脂四项中只血清总胆固醇结果有差别,其余三项各组间无明显变化,因此本次实验只测定血清总胆固醇。 4.药物治疗对各小鼠肠道粪便的细菌群落的影响 4.1细菌16S rRNA基因的PCR及DGGE分析 用粪便DNA提取试剂盒提取小鼠肠道粪便细菌DNA。提取后的细菌DNA置于-20℃保存备用。细菌16S rRNA基因的PCR扩增按Muyer G等的方法进行,扩增片段200bp。引物序列：F341-GC:5'-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3'; R518:5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。PCR反应条件为：94℃4min;94℃30s,56℃30s,72℃60s,40个循环；72℃7min延伸。DGGE凝胶浓度8%,变性梯度范围为40%-60%（100%变性包括40%去离子甲酰胺和7M尿素）,60℃恒温80V电泳15h。之后用EB染色30min并用凝胶电泳成像系统扫描结果。 4.2DGGE指纹图谱分析 变性梯度凝胶电泳（DGGE）后的指纹图谱用Quantity One4.6分析。其参数设置为：用轨道法（Lane）进行背景消除,"Rolling Disk Size"取5-8之间；条带识别时,"Sensitivity"取10,"Shadows"选"Reject",用"Gauss-model Bands"对条带进行处理；"Tolerance"选1%；之后用该软件的"UPGAMA"法进行聚类分析。 4.3荧光定量PCR检测肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌的变化 以小鼠肠道粪便细菌DNA为模板,用特异性引物分别扩增乳酸杆菌、双歧杆菌及拟杆菌。 乳酸杆菌引物序列如下,FLacto05:AGCAGTAGGGAATCTTCCA RLacto04:CGCCACTGGTGTTCYTCCATATA 双歧杆菌引物序列如下,Bif164F:GGGTGGTAATGCCGGATG Bif601R:TAAGCGATGGACTTTCACACC 拟杆菌引物序列如下,Bac708F:CACGAAGAACTCCGATTG Bac1080R:CACTTAAGCCGACACCT 荧光定量PCR反应程序为：首先95℃30s,然后95℃30s,60℃45s,72℃30s,共40个循环,最后72℃1Omin结束。 内参基因采用细菌总数,引物序列如下, Uni331F:TCCTACGGGAGGCAGCAGT Uni797R:GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT 以细菌总数为参照,计算乳酸杆菌、双歧杆菌及拟杆菌的相对表达量。 结果 1.各组实验小鼠血清总胆固醇水平 C57BL/6小鼠用高脂饮食喂养,成功建立高脂血症小鼠动物模型。与常规饲料组比较,高脂饲料组血清总胆固醇显著升高（P<0.01）,说明高脂血症动物模型构建成功；中药低剂量组、中药高剂量组与常规饲料组比较血清总胆固醇显著升高,与高脂饲料组比较血清总胆固醇结果无明显差异,说明选用的中药黄连解毒汤不能降低血清总胆固醇。 2.药物治疗对各组小鼠血糖的影响 与常规饲料组比较,高脂饲料组血糖未见升高,常规饲料加抗生素组、中药低剂量组血糖降低（P<0.05）,中药高剂量组血糖显著降低（P<0.01）。结果表明黄连解毒汤可能具有降低血糖的作用。 3.药物治疗后各组小鼠前后体重的变化 各组小鼠在治疗前体重差异无显著性,治疗后中药高剂量组体重低于常规饲料组、高脂饲料组、常规饲料加抗生素组（P<0.05）。 4.各小鼠肠道菌群PCR-DGGE指纹图谱分析 4.1多样性指数、物种丰度、相似性系数分析 高脂饲料组的多样性指数、物种丰度都高于其他各组；中药高、低剂量组次之；高脂饲料加抗生素组两指标均为最低。从各组相似性系数（Cs）可以得知高脂饲料组与常规饲料组相似性最高（0.63）,高脂饲料加抗生素组、中药低剂量组与常规饲料组相似性也比较高（0.59、0.48）,而各组与两个抗生素组相似性最低（0.16～0.19）。 4.2DGGE聚类分析 整体来说,如果除去中药低剂量组影响,常规饲料组、常规饲料加抗生素组、高脂饲料加抗生素组、中药高剂量组大都各自聚为一簇。这说明这五组肠道细菌组内相似性较高,而组间差异性较大。中药低剂量组的样本可与常规饲料组、高脂饲料组聚为一簇。这说明中药低剂量组各只小鼠的肠道细菌群落差别很大,并且与其他各组的相似性、差异性都不尽相同。 5.荧光定量PCR检测肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌的变化 常规饲料加抗生素组、高脂饲料加抗生素组这两组小鼠乳酸杆菌、双歧杆菌及拟杆菌没有表达,说明广谱抗生素的使用抑制了这三种益生菌的生长。与常规饲料组相比,高脂饲料组乳酸杆菌显著下降（P<0.05）,是常规饲料组的0.04倍,双歧杆菌、拟杆菌虽有降低,分别是常规饲料组的0.59倍、0.44倍,但可能因样本数不足,没有统计学意义。与高脂饲料组比较,中药低剂量组乳酸杆菌表达量是其2.73倍,双歧杆菌表达量是其3.93倍,拟杆菌表达量是其1.64倍,中药低剂量组这三种细菌表达量都有所提高,但可能因样本数不足,没有统计学意义。 结论 高脂饲料组小鼠肠道菌群多样性指数、物种丰度均高于其他各组,但益生菌乳酸杆菌降低。与高脂饲料组比较,黄连解毒汤低剂量组的乳酸杆菌表达量是其2.73倍,双歧杆菌表达量是其3.93倍,拟杆菌表达量是其1.64倍,黄连解毒汤低剂量组三种益生菌的表达有上升趋势。