钠离子通道阻断剂利多卡因体内外干预关节软骨的生物学效应

随着社会老龄化的发展及生活质量的提高，骨关节炎越来越受到人们的重视。为了缓解关节疼痛及关节镜手术中镇痛的需要，临床上常行关节腔内利多卡因注射。国外报导布比卡因关节腔内注射引起了关节软骨的溶解，利多卡因对关节软骨的安全性越来越引起人们的重视。 关节软骨是透明软骨，覆盖在构成活动关节的相对骨面。均匀传递负荷，扩大关节负重面，缓冲震荡，降低关节活动时的磨擦。关节软骨没有血管、神经和淋巴管，自我修复能力很差。关节软骨主要由软骨细胞和基质构成，其中软骨细胞只占1%--10%，基质的主要成份为水、蛋白多糖和II型胶原。软骨细胞合成和分泌蛋白多糖和II型胶原，维持软骨基质的新陈代谢；基质则围绕在软骨细胞周围，使软骨具有弹性和张力强度。软骨细胞和基质互为存在的条件，软骨细胞的凋亡和坏死会影响基质的合成和分泌；基质的毁损将导致软骨细胞的破坏。在正常情况下，基质更新的速度很慢,基质的合成和分泌处于动态平衡中，并受多种因子的调控，如MMPs与TIMPs的动态平衡是保证生理状态下基质正常更新改建的关键，一旦平衡破坏则引发各种病理过程。 软骨细胞是非兴奋细胞，细胞膜上存在的多种离子通道是细胞进行各种生命活动的物质基础：转运细胞代谢必需的离子；调节细胞内外渗透压；参与电冲动形成；参与信号传递，使有机体更好地适应环境条件。离子通道的活性受多种调控因素的调节，有多种兴奋剂与阻断剂:如利多卡因、河豚毒特异性地阻断Na+通道，四乙胺选择性地阻断K+通道。 利多卡因是选择性Na+通道阻滞剂，能够选择性地阻断电压门控式Na+通道，抑制Na+内流，同时对K+通道也有阻断作用。造成静息膜电位上升，使H+、Ca2+在细胞膜内外电压梯度的影响下内流增加，PH值降低；同时由于细胞渗透压降低，细胞功能受损。有文献报导当利多卡因干预浓度达0+1mmol/L时，即可阻断软骨细胞Na+通道，干预浓度大于2+5 mmol/L、时间超过48小时观察到有细胞出现凋亡现象，并认为细胞凋亡缘于利多卡因的细胞毒性作用，并由此提出利多卡因时间及浓度依赖的细胞毒性作用的理论。 鉴于此，我们希望通过体内及体外实验观察接近临床浓度的利多卡因作用于兔膝关节软骨细胞时软骨细胞的活性、基质的合成及分泌、炎性因子分泌以及关节软骨形态的变化，以期获得有益于临床的资料，避免医源性的关节软骨损害。 目的 为了进一步揭示电压门控式Na+通道阻滞剂利多卡因对关节软骨的影响，我们设计了不同浓度、不同作用时限下利多卡因干预软骨细胞的体内和体外实验，通过测定各种条件下关节软骨细胞活性、细胞外基质合成、分泌、炎性因子含量及关节软骨形态的变化，探求利多卡因安全浓度、剂量及疗程，以期为临床应用提供借鉴。 方法 2月龄新西兰大白兔56只，随机分为体外实验组和体内实验组。体外实验组：空气栓塞处死。无菌手术切取双膝关节软骨，分离关节软骨细胞。不同浓度、不同时限利多卡因干预软骨细胞，用流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率；ELISA法检测软骨细胞分泌Ⅱ型胶原、GAG及MMP-3、TIMP-1的含量；RT-PCR检测软骨细胞内Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达。并对结果进行统计分析。体内实验组：在兔膝关节腔内注入接近临床对应浓度的利多卡因0.5ml，每周一次，分别于注射4周、12周、24周后，采取空气栓塞处死动物，通过大体观察、组织切片、免疫组化等方法观察动物关节软骨的变化；另外单次关节腔注射后，分别在注射后第1、2、4、8天检测关节软骨组织Ⅱ型胶原、Aggrecan mRNA的表达，然后对结果进行统计分析。 结果 体外实验结果 1：利多卡因诱发软骨细胞凋亡具有明显的时间依赖性和浓度依赖性。2.5mmol/L利多卡因干预软骨细胞，观察72小时无明显凋亡。 2：0.2mmol/L、2mmol/L利多卡因干预软骨细胞，0.2mmol/L组早期（第3天）抑制GAG分泌，晚期（第9天）GAG分泌明显增加（p<0.05）;利多卡因组与对照组相比Ⅱ型胶原的分泌有降低趋势（p>0.05）。2mmol/L组较对照组GAG及Ⅱ型胶原的分泌稍减少（p>0.05）。 3：0.2mmol/L、2mmol/L利多卡因干预软骨细胞，0.2mmol/L组早期（第3天）抑制MMP-3分泌，晚期（第9天）MMP-3与对照组相比分泌明显增加（p<0.05）；利多卡因组与对照组相比TIMP-1的分泌逐渐增高（p>0.05）。 2mmol/L组软骨细胞培养液中MMP-3含量与对照组相比明显增加（p<0.05）。而TIMP-1的含量无明显变化（p>0.05）。 4:2mmol/L利多卡因干预软骨细胞，Ⅱ型胶原mRNA的表达较对照组无统计学差异；早期（第3天）抑制Aggrecan mRNA ???×晚期（第9天）Aggrecan mRNA与对照组相比表达明显增加（p<0.05）? 体内实验结果 1：利多卡因干预4周时,兔膝关节软骨大体形态、HE染色及免疫组化与自体对照组均无差异,软骨表面光滑，结构完整，潮线清晰，软骨细胞数量如常，排列整齐，未见坏死崩解的软骨细胞；12周利多卡因与生理盐水对照组组织学观察发现,细胞略大,番红O深染,尽管两组对照软骨厚度无统计学差异,但利多卡因组有增厚的趋势；24周利多卡因组关节软骨表面切线层受损，Mankin's评分与生理盐水对照组有统计学差异。 2：5mmol/L利多卡因干预后第一天Ⅱ型胶原mRNA的表达明显增高，后表达量随时间而下降，第8天与对照组相比无统计学差异；Aggrecan mRNA第一天明显下降，后逐渐增高，第8天与对照组有统计学差异（p<0.05）。 结论 1：利多卡因干预软骨细胞时，具有浓度依赖性和时间依赖性细胞毒性。 2：关节腔内注射，常用剂量、浓度的利多卡因对关节软骨是安全的，但如果疗程过长，则有诱发和加重OA的风险。