FGF21在非诺贝特保护1型糖尿病肾病中的作用及其机制研究

背景:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见的微血管并发症,是慢性肾脏病进展为终末期肾病的首要病因,是DM并发症中致死率最高的疾病之一。尽管多种机制参与了DN的形成,但高血糖导致的氧化应激(oxidative stress,OS)学说是目前公认的贯穿DM并发症发生发展过程的重要机制。因此通过分子机制调节肾脏抗OS能力,如调节抵抗细胞内OS重要的转录因子-核因子NF-E2相关因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)在降低DN危险因素中起着重要的作用。生理条件下,Nrf2位于细胞质中,与细胞质中Nrf2抑制剂肌动蛋白结合蛋白Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(kelch-like ECH-associated protein 1,Keap1)结合且经泛素蛋白酶体途径降解;应激状态时,Nrf2从Keap1中解离,然后转位进入细胞核,与靶基因中的抗氧化反应元件(antioxidant responsive element,ARE)序列结合,启动下游抗氧化基因的转录,提高细胞内抗OS能力,保护机体内环境稳态。因此,刺激Nrf2的抗氧能力将成为控制及延缓DN进展的重要策略。与研发新药带来不可预知的副作用相比,探索现有的已被广泛用于临床治疗其他疾病的药物的新用途将成为临床治疗DM并发症的首选。非诺贝特作为贝特类代表药是过氧化物酶体增生物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARα)的激动剂,通过降低血清甘油三酯和总胆固醇水平起到降脂作用,近30年来被广泛用于临床治疗不同类型的高脂血症。动物实验发现非诺贝特可通过降低肾脏脂毒性改善2型DM所致的肾脏损伤。非诺贝特具有抗OS作用是通过对阿霉素诱导的肾脏损伤具有潜在保护作用发现的。目前的研究表明非诺贝特对DN的保护作用是独立于其降脂作用的。然而,关于非诺贝特是否能改善1型DM所致的肾脏损伤的机制研究较少。成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factors 21,FGF21)是PPARα的直接靶基因,非诺贝特作为PPARα的激动剂可直接调控糖脂代谢关键蛋白FGF21的合成和分泌。FGF21可通过多重机制保护器官的损伤,包括上调Nrf2增加抗氧化能力,起到减少肝细胞炎症、细胞凋亡和肥大的作用,此作用独立于降脂效应。因此,本研究探讨除降脂效应外,非诺贝特是否具有保护1型DM所致的肾脏损伤的作用及是否通过刺激FGF21上调激活Nrf2增加机体抗OS能力。目的:明确非诺贝特对1型DN是否具有保护作用及FGF21在非诺贝特保护1型DN中的作用及潜在机制。方法:单次腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)150mg/kg建立1型DM小鼠模型,对照组给予等剂量柠檬酸钠缓冲液。建模成功后,糖尿病组与对照组小鼠随机分组给予非诺贝特100mg/kg,隔日一次灌胃干预。在实验终点时,收集血、尿和肾组织用于蛋白、m RNA水平检测和组织病理学分析。应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中甘油三酯、胆固醇、FGF21水平及尿白蛋白与肌酐比值。肾脏纤维化(CTGF,TGF-β1),炎症损伤(PAI-1,TNF-α),氧化应激(3-NT,4-HNE,MDA)和凋亡(Bax/Bcl-2,Caspase-3,TUNEL)分别通过天狼星红、Masson三色法染色、免疫印迹、末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d UTP切口末端标记技术、硫代巴比土酸法等方法检测。同时,我们应用免疫荧光技术和实时定量聚合酶链式反应等方法对小鼠肾脏PI3 kinase(PI3K),Akt,GSK-3β,Fyn的表达和Nrf2及其下游基因HO-1、NQO1的表达和功能进行检测。第一部分实验:研究非诺贝特对1型DN的影响。本实验选取雄性C57BL/6J小鼠,随机分为4组:对照组(Ctrl)、非诺贝特组(FF)、糖尿病组(DM)、糖尿病+非诺贝特组(DM/FF)。给药3个月后,每组处死5只小鼠收集样本,其余小鼠继续喂养3个月,共计6个月后,处死小鼠收集样本,备实验分析。第二部分实验:研究非诺贝特对1型DN的影响是否依赖于FGF21。本实验选取雄性FGF21基因敲除(FGF21-null)小鼠和C57BL/6J小鼠,随机分为:对照组(Ctrl)、非诺贝特组(FF)、糖尿病组(DM)、糖尿病+非诺贝特组(DM/FF)。给药3个月后,处死小鼠收集样本,备实验分析。结果:(1)在1型DM小鼠模型中,通过检测非诺贝特治疗后小鼠体重、血浆胆固醇和甘油三酯水平、尿蛋白/肌酐和血糖发现,非诺贝特可恢复DM所致的小鼠体重降低,改善高血糖所致的脂代谢异常,减少DM引起的尿蛋白的排泄,进而改善肾脏功能,但非诺贝特对小鼠的血糖没有影响。(2)在1型DM小鼠模型中,通过观察非诺贝特治疗后肾脏组织纤维化、炎症反应、细胞凋亡及氧化应激相关指标的变化,结果显示非诺贝特治疗后明显减轻了DM小鼠肾脏组织纤维化、炎症反应、细胞凋亡及氧化应激水平,对DN具有保护作用。(3)通过检测各组小鼠肾脏组织Nrf2的表达及其转录活性,结果显示3个月时DM可引起小鼠肾脏组织Nrf2代偿性增高,非诺贝特治疗后进一步上调Nrf2的表达及其转录活性,6个月时DM导致的肾脏组织Nrf2的表达及其转录活性下降,通过非诺贝特治疗可得到明显改善。同时发现,DM导致肾脏组织FGF21水平下降,非诺贝特治疗可上调FGF21在小鼠肾脏中的表达。(4)通过检测各组小鼠肾脏组织磷酸化PI3K、Akt、GSK-3β及Fyn表达,结果显示DM导致肾脏组织磷酸化PI3K、Akt、GSK-3β表达水平下降增加细胞核内Fyn表达,非诺贝特可上调磷酸化PI3K、Akt、GSK-3β表达减少细胞核内Fyn蓄积。(5)通过检测FGF21-null小鼠非诺贝特治疗后肾脏功能、病理学改变、纤维化、炎症反应、细胞凋亡及氧化应激相关指标的变化,结果显示在FGF21-null小鼠中非诺贝特对DM小鼠肾脏功能、病理学、纤维化、炎症反应、细胞凋亡及氧化应激变化失去保护作用,说明非诺贝特对肾脏的保护作用依赖于FGF21。(6)通过检测FGF21-null小鼠非诺贝特治疗后FGF21和Nrf2表达及其转录活性,结果显示在FGF21-null小鼠中未检测到FGF21表达并且非诺贝特治疗不能上调Nrf2的表达及其转录活性,说明非诺贝特上调Nrf2的表达、激活其转录活性依赖于FGF21。(7)通过检测FGF21-null小鼠非诺贝特治疗后磷酸化PI3K、Akt、GSK-3β及Fyn表达,结果显示FGF21基因敲除后阻断非诺贝特对PI3K、Akt、GSK-3β磷酸化的上调且增加细胞核内Fyn蓄积,说明非诺贝特对肾脏的保护作用依赖于FGF21。结论:(1)非诺贝特可降低1型糖尿病小鼠肾脏组织炎症损伤、纤维化、细胞凋亡、氧化应激,减少尿蛋白排出,从而延缓DN进展。(2)非诺贝特可上调1型糖尿病小鼠肾脏FGF21水平,FGF21基因敲除小鼠1型糖尿病所致的肾脏损伤进一步加重,给予非诺贝特治疗未见改善,说明非诺贝特通过上调FGF21延缓DN进展。(3)非诺贝特在野生型小鼠中可诱导Nrf2及其下游抗氧化基因上调,FGF21基因敲除后上述作用消失,说明非诺贝特诱导FGF21进而上调Nrf2及其下游抗氧化基因对延缓DN进展起到重要作用。(4)FGF21可通过PI3K/Akt/GSK-3β/Fyn信号通路调节Nrf2抗氧化功能。(5)非诺贝特通过上调FGF21激活PI3K/Akt/GSK-3β/Fyn信号通路进而上调Nrf2抗氧化功能,从而延缓DN进展。