β-D-半乳糖苷酶酶学性质及制备高纯度低聚半乳糖关键工艺的研究

低聚半乳糖是一种功能性低聚糖，它是母乳组成成分之一，具有重要的生理功能，2008年国家卫生部批准其为新资源食品，可以应用于食品加工中，因此在食品保健品行业有重要应用价值。日本和欧洲低聚半乳糖市场需求量非常大，而在我国仍处于起步阶段。目前,市场上出售的低聚半乳糖浓度大多为27%65%，通常纯化低聚半乳糖的方法操作复杂，无法完全除去单糖和乳糖，在我国高纯度低聚半乳糖还没有实现工业化生产。 低聚半乳糖主要是通过β-D-半乳糖苷酶催化底物乳糖发生转糖苷作用，将糖基转移到乳糖基上生成低聚半乳糖。本文通过实验室筛选所得菌株马克斯克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）SK16.001发酵得到的β-D-半乳糖苷酶催化乳糖反应生成低聚半乳糖。同时利用该菌株发酵消耗副产物葡萄糖和半乳糖以及未反应的乳糖，以此达到纯化的目的。 本文对纯化的K. marxianus SK16.001β-D-半乳糖苷酶的进行研究，该酶具有催化乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的特性，也具有催化糖基转移生成低聚半乳糖的能力。该酶水解和转糖苷催化反应最适pH相同，但最适温度为35oC和40oC，金属离子对其影响也不同，Na+能够抑制酶的水解作用，K+能够抑制酶的转苷作用。 研究了酶法合成低聚半乳糖的关键工艺参数，通过对四种仪器破碎进行细胞破碎，比较发现高压细胞破碎仪是实验室破碎酵母最佳仪器，而高压均质机适合工业化生产应用，但破壁效率不如高压细胞破碎仪。通过单因素和正交试验确定了粗酶液与底物反应的最佳条件：底物乳糖浓度400g/L，加酶量1.0U/g乳糖，反应温度为40oC，研究发现磷酸钠缓冲液能够促进合成低聚半乳糖，这与Na+抑制酶向水解方向进行相符。扩大反应体系至300L，反应24h以后低聚半乳糖含量可以达到42%。 通过测定K. marxianus SK16.001生长过程中还原糖变化曲线可知酵母在达到发酵终点时还原糖完全被消耗掉，而此时酵母仍具有生长能力，因此可以将酵母加入酶转化得到的普通级低聚半乳糖混合糖液中进行发酵培养。发酵起始糖液浓度为20%，酵母添加量为15%，反应起始pH为7.0，同时反应过程中对pH进行控制，使pH保持在6.0-7.0之间，反应20h后，葡萄糖和半乳糖被完全消耗掉，乳糖部分被消耗掉，聚合度在3以上的低聚半乳糖不会被消耗，最终低聚半乳糖占总糖的93.07%，达到纯化低聚半乳糖的目的。