目的研究乌梅丸调控外泌体miR-148a-3p靶向APC/KARS蛋白在结肠癌进展中的作用方法通过TCGA数据库,寻找结肠癌和癌旁组织的差异基因,选择其中一个差异基因进行临床病理分型研究,并使用临床标本进行验证。使用R语言和在线数据库网站筛选合适的靶基因,交叉重叠后的到HUB基因。确定miR-148a-3p为本文研究对象,对交叉基因进行富集分析和文献搜索后,选择Wnt/β-catenin信号通路及其下游通路上的关键启动因子APC和KRAS用于后续体外实验检测。使用人结肠癌细胞系HCT15、HCT116,人结肠正常组织上皮细胞HIEC作为对照,通过体外实验研究,首先确定乌梅丸方水煎剂作用浓度最佳值,qRT-PCR检测外泌体miR-148a-3p在上述细胞中的表达情况,并对乌梅丸水煎剂作用后的细胞分泌外泌体及细胞本身生物学活性行相关检测,研究乌梅丸调控外泌体miR-148a-3p靶向APC/KRAS蛋白在结直肠癌进展中的作用。结果1.miR-148a-3p低表达与结直肠癌不良预后相关TCGA数据库结合临床结直肠癌组织,显示miR-148a-3p在结直肠癌组织中表达下调(P<0.05)。临床病理相关比较,Ⅲ-Ⅳ期患者较Ⅰ-Ⅱ期患者比较,miR-148a-3p的表达显示下降(P<0.05),在TNM分期看出未有周围淋巴结浸润的患者对比有周围淋巴结浸润的患者表达较高(P<0.05),无远处转移的患者较有远处转移的患者miR-148a-3p表达也较高(P<0.05)。肿瘤恶性度越高,miR-148a-3p的表达呈显著下降趋势。2.miR-148a-3p 可能靶向 APC/β-catenin/Wnt 及其下游 KRAS 基因经过数据分析,得到5个HUB基因,分别为:CDK1、AURKA、AJUBA、CD44、CDC6。对上述HUB基因进行文献分析后,发现均与APC/β-catenin/Wnt及其下游KRAS基因突变相关,为下一步验证miR-148a-3p在结肠癌上作用机制提供了理论基础。3.乌梅丸抑制肿瘤细胞分泌外泌体,抑制外泌体被肿瘤细胞摄取乌梅丸处理后的HCT116细胞来源外泌体形态无明显变化,能够完整表达CD81、TSG101、CD9和CD63,而细胞培养上清液中并未检测到外泌体标志物表达,影响外泌体进入HCT116细胞的能力,并可能抑制了其入核过程。4.乌梅丸方可通过外泌体miR-148a-3p调控抑制结直肠癌细胞活性,靶向APC/KRAS,增强其表达HIEC、HCT116和乌梅丸方+HCT116分泌的外泌体miR-148a-3p表达量逐步降低(P<0.05),乌梅丸显著抑制结直肠细胞增殖、迁移和侵袭能力,并能上调APC/KRAS的表达。结论1.miR-148a-3p在结直肠癌组织及其分泌的外泌体中均存在表达,且与癌旁组织相比均有表达差异,miR-148a-3p低表达与结直肠癌不良预后相关。2.乌梅丸方可以抑制两种CRC细胞的增殖,与时间和药物剂量呈依赖性关系,对正常人结肠组织上皮细胞系HIEC细胞毒性较小,该药成分安全。3.乌梅丸方可以调控肿瘤细胞外泌体miR-148a-3p的释放,明显减少外泌体数量,并抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭,促进凋亡。4.肿瘤细胞产生的外泌体可以被其细胞本身大量摄取,部分分布于细胞质,少量分布于细胞核。乌梅丸方可显著抑制外泌体分泌的数量,并抑制其进入肿瘤细胞能力,阻止入核过程。5.乌梅丸方可能通过调控外泌体miR-148a-3p靶向APC/KRAS表达,从而抑制CRC的发展进程。
