三种昆虫多糖的分离纯化与免疫活性研究

多糖是生物体内的重要大分子之一，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等多种生理功能，在医药和食品领域显示了很好的应用前景，因而受到人们的广泛关注。但是目前多糖研究主要以真菌、植物为主，动物多糖相对较少，昆虫多糖极少有人涉及，研究严重不足。昆虫是自然界种类最多、数量最大的生物类群，也是地球上最大的未被充分开发的资源。开展昆虫多糖的研究，有利于丰富活性多糖的来源，提高昆虫的附加值，深化昆虫资源的综合利用，为进一步开发昆虫食品或药物奠定理论和实验基础。 本论文以蚕（Bombyx mori Linnaeus）蛹、喙尾琵琶甲（Blaps rhynchoptera Fairmaire）、蟑螂（Periplaneta americana Linnaeus）为原料，利用现代分离纯化技术和仪器分析鉴定手段对这三种昆虫体内的多糖进行了较系统深入的研究，并进行了粗多糖对小鼠免疫系统的影响及急性毒性实验研究，主要研究内容和结果如下： （1）提取方法研究以提取温度、提取时间、碱浓度、酶活力为影响因子作正交实验设计，分别采用热水浸提、稀碱液提取、酶解提取等不同的方法对昆虫多糖进行提取，通过比较各种方法对昆虫多糖含量的影响，确定了适合每种昆虫多糖的提取方法：蚕蛹多糖SPPS适宜用碱液提取，最佳实验条件是碱液浓度为0.02mol／L，实验提取温度80℃，提取时间为3h；喙尾琵琶甲多糖BFPS和蟑螂多糖CPS宜用蛋白酶水解法提取，最佳实验条件分别是提取温度50℃，酶量200μg/g，提取时间为1h以及提取温度50℃，酶量200μg／g，提取时间为2h。在上述最佳条件下所得三种粗品中多糖含量平均为27.9％、6.0％、8.0％。 （2）脱蛋白与脱色研究以蚕蛹多糖为研究对象，比较了Sevage法、酶法结合Sevage法、三氯乙酸法脱蛋白效果以及活性炭和过氧化氢脱色效率。结果Sevage法、酶法结合Sevage法蛋白脱出率分别是25.48％和19.41％，而三氯乙酸法处理的多糖蛋白脱除率高达51.27％，远远高于其他两种方法；过氧化氢脱色后，蚕蛹多糖溶液由深棕色变为淡黄色，醇沉后多糖颜色为浅黄色，脱色效果明显好于活性炭。将三氯乙酸和过氧化氢用于其他两种多糖，效果较好。实验结果表明，三氯乙酸和过氧化氢用来脱除三种昆虫多糖中的蛋白和色素效果较好。 （3）分离纯化研究利用DEAE-Sephaose离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析对多糖进行纯化，从蚕蛹粗多糖中分离得到两个组分PSPPS-1和PSPPS-2，喙尾琵琶甲一个组分PBFPS-3，蟑螂粗多糖一个组分PCPS-2。其中PCPS-2经纯度鉴定，初步判定为纯品，理化指标检测多糖含量45.84％，蛋白含量39.15％，可能是糖一蛋白复合物。其他组分有待进一步检测。 （4）三种粗多糖免疫活性研究和急性毒性对三种粗多糖进行了小鼠免疫调节功能和急性毒性试验，免疫结果显示，蚕蛹粗多糖能显著提高ICR种小鼠的脾脏指数、巨噬细胞吞噬指数、淋巴细胞转化率和血清溶血素OD值，表明蚕蛹粗多糖具有较好的提高机体非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫的功能；喙尾琵琶甲粗多糖和蟑螂粗多糖能显著提高ICR种小鼠的脾脏指数、巨噬细胞吞噬指数和血清溶血素OD值，但对淋巴细胞转化率影响不明显，表明喙尾琵琶甲粗多糖和蟑螂粗多糖对小鼠非特异性免疫和体液免疫功能有调节作用，对细胞免疫功能的调节作用不明显。急性毒性实验结果显示，蚕蛹和蟑螂粗多糖的最大耐受量（MTD）是500.0mg／kg体重，喙尾琵琶甲粗多糖的半数致死量LD50为492.43mg／kg体重。 研究结果表明，蚕蛹多糖适宜采用碱液法提取，喙尾琵琶甲多糖和蟑螂多糖宜用蛋白酶水解法提取；三氯乙酸法和过氧化氢法脱除三种昆虫多糖的蛋白和色素效果较好；DEAE-Sepharose离子交换柱层析和Sephadex G-100凝胶柱层析可以较好地分离三种昆虫多糖的各组分；蚕蛹粗多糖具有较好的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫功能，喙尾琵琶甲粗多糖和蟑螂粗多糖对小鼠非特异性免疫和体液免疫功能有调节作用，对细胞免疫功能的调节作用不明显。 本论文首次利用蚕蛹、喙尾琵琶甲和蟑螂为原料，对这三种昆虫体内的多糖进行了较系统深入的研究，首次发现蟑螂和云南民间药用昆虫喙尾琵琶甲的酶解醇沉物具有非特异性免疫和体液免疫调节功能，再次验证了昆虫体内也含有丰富多糖物质的观点，发现昆虫多糖以静脉注射的方式给药具有调节机体免疫功能的生物活性，为昆虫药物的研究与开发提供理论基础和实验基础。