血吸虫病(Schistosomiasis)是一种严重危害人类健康、影响社会经济发展的人畜共患寄生虫病,在全球76个国家和地区广泛流行。长期以来,人们一直在寻找一种能够有效控制并消灭血吸虫的方法,但某些地区的地理环境或经济条件限制了大规模灭螺工作或传染源控制工作的开展,所以就目前而言,药物治疗血吸虫病的仍将会是控制血吸虫病的主要手段。目前,全球范围内控制血吸虫病流行的手段是降低发病率,化学药物吡喹酮(praziquantel,PZQ)因其出色的疗效和广泛的适应性被WHO指定为广谱抗血吸虫、蠕虫药,使其成为抗血吸虫病药物的首选。但在吡喹酮长期大范围使用过程中,日本血吸虫及曼氏血吸虫潜在的耐药性风险也越来越引起人们的重视。因此,作为技术储备,寻找吡喹酮之后的备选抗血吸虫病新药已迫在眉睫。白头翁(Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel)为多年生草本植物,其干燥根具有清热解毒、凉血止痢、抗肿瘤、抗炎、抗病原微生物,抗寄生虫等作用。临床上常用于阿米巴痢疾、细菌性痢疾和妇科炎症等疾病的治疗。白头翁总皂苷对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)虫卵、毛蚴、尾蚴均有一定的杀灭作用,并且能降低日本血吸虫糖原和蛋白质的含量对其代谢相关酶类也有一定的抑制作用。本课题通过研究白头翁皂苷提取物的单体Hederacolchiside A(HSA)对体内发育不同阶段日本血吸虫和曼氏血吸虫(S.mansoni)的作用、对日本血吸虫成虫表皮及新陈代谢的影响及对感染日本血吸虫、曼氏血吸虫小鼠免疫调节的影响,为HSA成为抗血吸虫新药提供理论依据及实验基础。实验首先对感染55±5条日本血吸虫尾蚴的ICR小鼠在其感染后的1d、7d、14d、21d、28d、35d分别给予不同药物治疗。具体如下,腹腔注射8 mg/kg HSA或6 mg/kg HSA连续5天;一次口服300 mg/kg PZQ或300 mg/kg青蒿琥酯(artesunate,ART)。于感染后7周检测不同药物对不同发育阶段日本血吸虫的影响。不同剂量的HSA在不同感染时期给药对体内日本血吸虫均有一定的杀伤作用,在感染后1d、7d给予8 mg/kg HSA治疗,日本血吸虫减虫率分别为97.2%及92.9%,减雌率分别为94.7%及89.5%,减卵率分别为99.3%及98.7%,效果均优于同时期的阳性对照PZQ及ART给药组。其余时期HSA给药组的药效虽不及阳性对照组PZQ或ART,但HSA给药后小鼠体内日本血吸虫总虫数、雌虫数及肝脏虫卵量比未给药对照组显著减少。接着对感染45±5条曼氏血吸虫尾蚴的ICR小鼠在其感染后的1d、7d、21d、42d、49d给予不同药物治疗,具体如下,腹腔注射8 mg/kg HSA连续5天;一次口服300 mg/kg PZQ或300 mg/kg ART。于感染后8周检测不同药物对不同发育阶段曼氏血吸虫的影响。8 mg/kg HSA在不同感染时期给药对体内曼氏血吸虫均有一定的杀伤作用,在感染后1d、7d给予8mg/kg HSA治疗,曼氏血吸虫的减虫率分别为88.6%及80.7%,减雌率分别为92.9%及85.0%,减卵率分别为98.6%及95.3%,效果均优于同时期的阳性对照PZQ及ART给药组。其余时期HSA给药后小鼠体内曼氏血吸虫总虫数、雌虫数及肝脏虫卵量相较于未给药对照组显著减少。此实验结果表明HSA对体内发育不同阶段的日本血吸虫及曼氏血吸虫均具有杀伤作用,感染后1d及7d给药组疗效优于PZQ及ART,有望成为抗日本血吸虫及曼氏血吸虫的候选药物。为了进一步探讨HSA对于血吸虫病引起的炎症反应及虫卵肉芽肿病变有无疗效,我们对感染日本血吸虫或曼氏血吸虫后不同时期给予HSA、PZQ或ART治疗,分别于7或8周检测小鼠体重、脾重及脾重/体重、小鼠体内的免疫球蛋白(Ig G)及细胞因子(tumor necrosis factor(TNF)-α、interleukin(IL)-4、IL-17a)的表达水平、小鼠肝脏虫卵肉芽肿形态及大小和对小鼠肝脏早期纤维化的影响。结果显示,在日本血吸虫感染21d前给予不同剂量HSA治疗能明显提高小鼠的体重,显著下调小鼠的脾重/体重,并能明显降低TNF-α及IL-17a表达水平。日本血吸虫感染后35d前给予低剂量HSA治疗,均能明显下调IL-4的表达,并且在其感染日本血吸虫的7d、14d、21d低剂量给药组小鼠免疫球蛋白Ig G表达下调明显。HSA能显著提高曼氏血吸虫感染49d前小鼠的体重,显著下调小鼠的脾重/体重。曼氏血吸虫感染21d前给予HSA治疗能明显降低IL-4的表达,在感染后1d、7d、21d、42d给予HSA治疗能明显下调TNF-α的表达,在感染后1d、7d、21d、49d给予HSA治疗能明显抑制IL-17a的表达,但在曼氏血吸虫感染后期的42d及49d对小鼠进行HSA治疗,才能明显降低免疫球蛋白Ig G表达。曼氏血吸虫感染与日本血吸虫感染后HSA给药组小鼠情况类似,在早期给予HSA治疗对于肉芽肿的治疗效果明显,随着两种血吸虫发育的进程,给药时间越晚小鼠肝脏病变程度越严重。给予不同剂量HSA治疗,均能显著的降低所有感染阶段小鼠肝脏虫卵肉芽肿的平均直径。感染日本血吸虫或曼氏血吸虫7d前给予HSA治疗小鼠肝脏细胞排列规则,形态正常,极少有虫卵沉积,淋巴细胞侵润现象极不明显,形态上与正常肝脏组织极为相似。并且在感染7d前给予HSA治疗小鼠肝脏中转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、金属蛋白酶抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP-1)、Ⅰ型胶原(collagen TypeⅠ)极少量表达。综合上述结果我们发现,在感染日本血吸虫或曼氏血吸虫早期给予HSA治疗,感染7-8周后能显著下调小鼠的免疫反应,减少肝脏肉芽肿的形成,提示了HSA有希望成为预防及辅助治疗血吸虫病药物。最后检测HSA对体外培养日本血吸虫成虫的作用,利用扫描电子显微镜进行扫描观察血吸虫表皮的形态变化,并感染日本血吸虫42d利用8 mg/kg HSA腹腔注射24h后检测虫体的糖原(glycogen),蛋白(protein),酸性磷酸酶(Acid phosphatase,ACP),碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)及超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的变化,来初步探讨HSA对日本血吸虫的作用机制。研究发现虫体对药物的敏感性呈浓度依赖及时间依赖性,HSA对成虫的100%致死浓度12h为0.5μg/ml。阳性对照PZQ组12h成虫100%致死浓度则需要30μg/ml。HSA在相同的作用时间成虫100%致死浓度比阳性对照组更低。HSA孵育4h的日本血吸虫雌、雄虫体表海绵样结构排列混乱,皮层褶脊肿胀融合形成裂痕,感觉乳突上的纤毛消失,感觉乳突塌陷,部分表皮溃烂皮下组织暴露。并且在HSA对用下,日本血吸虫体内糖原、蛋白、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶及超氧化物歧化酶比未经处理的对照组显著下调。这些实验结果说明HSA作用于日本血吸虫可能对其新陈代谢及抗氧化能力有一定的影响,进而通过宿主的免疫防御,最终杀灭虫体。
