转化山葡萄ICE基因培育抗寒葡萄新种质的研究

葡萄属于葡萄科(Vitaceae)葡萄属(Vitis. Linn.),是一种栽培价值很高的果树。然而葡萄冻害给生产带来很大损失,因此培育抗寒品种迫在眉睫。ICE基因能编码bHLH转录因子,其在低温诱导下能使一系列冷诱导基因COR表达,从而使转基因植株的抗寒性得到提高。本研究以栽培品种‘美人指’葡萄(Vitis vinifera L.'Manicure Finger')和砧木品种'1202'(Mourvedre×Rupestris)葡萄为材料,采用农杆菌介导法将ICE基因导入‘美人指’葡萄中并对转基因株系做抗寒鉴定；建立‘1202’葡萄砧木不定芽再生体系并通过花粉管通道法将ICE基因导入难以转化的‘1202’葡萄砧木中,获得抗寒性较强的转基因葡萄,以期培育葡萄新种质。本研究结果如下： 1.通过农杆菌介导法,将从山葡萄中克隆的ICE基因转到‘美人指’葡萄中,经过潮霉素筛选,总共获得5个转基因抗性株系。GUS瞬时表达检测5个抗性株系,结果均呈阳性；经过PCR检测,5株GUS阳性株系均检测到目的条带；进一步进行RT-PCR检测,初步证实,有3个生根株系的ICE基因已经整合进‘美人指’葡萄的基因组中。 2.经过前期分子检测得到的3株美人指转基因葡萄株系,将其做低温处理并表型分析,从而筛选出最抗寒株系。对最抗寒的株系测定丙二醛(MDA)、可溶性糖(soluble suger)、超氧化物岐化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)、脯氨酸(praline)等生理指标。结果表明：通过导入ICE基因,植物体内的MDA含量减少,SOD、POD、CAT的活性及游离脯氨酸的含量提高,从而转基因葡萄的抗寒能力增强。 3.以葡萄砧木‘1202’为试材,研究了不同外植体类型、不同植物生长调节剂浓度及配比、外植体放置方式等对其不定芽再生频率的影响。结果表明：叶片的再生效果最好,最高再生频率为68.78%,最适宜葡萄砧木‘1202’不定芽再生的培养基为MS+TDZ1.0mg/L+IBA0.01mg/L+蔗糖30g/L+5.5g/L琼脂,pH5.8,最适宜叶片放置方式为近轴面接触培养基。在上述条件下,研究建立起葡萄砧木‘1202’离体不定芽再生体系,再生的葡萄苗40天后移栽,达到90%的成活率。 4.以‘1202’葡萄砧木的花序为转化ICE基因的受体,农杆菌介导并结合花粉管通道法对‘1202’葡萄进行转化,利用GUS染色、PCR和RT-PCR方法检测,共得到3株GUS阳性株系,3株PCR阳性株系,1株RT-PCR阳性株系,初步说明已经整合ICE基因的‘1202’葡萄得到表达。