（木奈）多酚氧化酶基因及5'端调控序列的克隆

(木奈)(Prunus salicina Lindl. var. cordata J.Y.Zhang et al)生产上普遍存在果肉的褐变现象,造成果实的食用品质和耐贮性下降,甚至丧失其商品价值。(木奈)果肉褐变是多酚类物质、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)与氧结合起酶促反应的结果。本研究采用RT-PCR、RACE和染色体步移等分子生物学技术,从(木奈)嫩芽和果肉中分离PPO基因及5′端调控序列,为进一步采用反义RNA技术,进行遗传转化,解决(木奈)果肉褐变问题开辟一条新的遗传改良途径。主要试验结果如下: 1.建立了(木奈)基因组DNA的提取和纯化方法。为解决(木奈)组织器官内多酚类物质、多糖、色素等物质的干扰,本试验以(木奈)嫩芽为材料,加入10%(W/W)PVPP与材料充分研磨,提取缓冲液中β-巯基乙醇的浓度为1%(V/V);用氯仿/异戊醇(24:1)抽提裂解液2次,在所获得的上相中,加入1/10体积经65℃预热的NaCl/CTAB溶液,混匀,再用氯仿/异戊醇(24:1)连续抽提2次;在DNA粗提液中加入2/3体积的5M NaCl和3倍体积冰冷的无水乙醇沉淀DNA。结果表明,该方法能有效地去除(木奈)嫩芽中多酚和多糖等杂质,所得DNA样品比较纯净、完整,可以直接用于后续的PCR扩增、酶切和染色体步移。 2.建立了(木奈)嫩芽总RNA的提取和纯化方法。通过加入10%(W/W)PVPP与材料共研磨,并在TriZoL提取液中加入1%(V/V)β-巯基乙醇;在匀浆液中加入终浓度为20%乙醇沉淀多糖;在裂解液抽提的上相中加入终浓度为3MLiCl沉淀RNA;在RNA的粗提液中加入1/30体积的3M NaAc(pH5.2)和0.1倍体积的无水乙醇沉淀多糖。试验结果表明,该方法有效地去除了(木奈)嫩芽中多酚、多糖等杂质,获得纯净、完整的RNA样品,直接用于后续的RT-PCR和RACE反应。 3.建立了(木奈)果肉总RNA提取和纯化方法。提取缓冲液中的Tris-HCl和EDTA的pH值为8.8,CTAB的浓度为2.5%(W/V),并加入0.5%SDS(W/V),中和果肉中的有机酸;在裂解后的果肉样品中加入终浓度为15%(VN)无水乙醇,用氯仿抽提2次;在RNA的粗提液中加入1/30体积3M NaAc(pH5.2)和0.1倍体积无水乙醇沉淀多糖2次。试验结果表明,该