第一部分ASP-PCR和FQ-PCR方法检测Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性的比较
目的探讨Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性准确可靠的实验检测方法。
方法运用等位基因特异引物-聚合酶链式反应(allelic specific primer polymerase chain reaction, ASP-PCR)技术及实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)技术检测Klotho基因G-395A、F352V、C370S位点的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP),比较分析两种方法对上述三个SNP位点检测的差异。
结果①ASP-PCR方法检测G-395A位点的实验结果不稳定、重复性差；F352V位点未发现V等位基因扩增产物；C370S位点的目的扩增片段不清晰,非特异性扩增产物多。②FQ-PCR方法检测G-395A、F352V、C370S位点的实验结果稳定、重复性好、效果理想、易于判断基因型,测序后基因型结果一致。结论ASP-PCR技术可能不适用于Klotho基因G-395A、F352V、C370S位点的多态性检测,FQ-PCR技术能准确进行这三个位点的多态性分析。
第二部分Klotho的三个位点SNP与2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性研究
目的探讨Klotho勺3个SNP位点(G-395A,F352V,C370S)基因型与中国昆明地区汉族人2型糖尿病及2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的相关性。
方法运用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)技术,分别对237例2型糖尿病(B组)患者[无下肢动脉粥样硬化(B1)组79例,合并下肢动脉粥样硬化(B2)组158例]和85例健康对照者(A组)检测Klotho基因3个SNP位点的基因型,并比较分析各组间基因型频率、等位基因频率及相关临床指标。结果①Klotho基因G-395A多态性,GG、GA及AA基因型频率分别为69.9%(225例)、25.8%(83例)、4.3%(14例),等位基因G和A的频率分别为82.8%和17.2%。②Klotho基因F352V、C370S位点间为完全连锁不平衡,所有样本中未发现突变纯合型(VV、SS型),杂合型(FV、CS型)仅发现2例,其余均为野生型(FF、CC型)。③Klotho基因G-395A多态性在A组和B组中的基因型及等位基因频率无统计学差异(χ2=0.290,P=0.590；χ2=0.229,P=0.633),B2组的GA+AA基因型频率高于B1组(χ2=4.456,P=0.035)。④Klotho基因G-395A的杂合型GA及纯合型AA与2型糖尿病下肢动脉粥样硬化的发生独立相关(OR=3.199,95%CI：0.860-11.893)。结论①在中国昆明地区汉族人中存在Klotho基因G-395A、F352V、C370S多态性,F352V和C370S位点间为完全连锁不平衡,其多态性罕见。②Klotho基因G-395A位点的杂合型GA及突变纯合型AA可能是2型糖尿病合并下肢动脉粥样硬化的遗传危险因子。
第三部分血浆Klotho水平与2型糖尿病及骨密度改变的相关性研究
目的探讨昆明地区汉族人群中血浆中Klotho水平与2型糖尿病(T2DM)及骨密度(BMD)改变的相关性。方法采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(Enzyme linked immuno sorbent assay, ELISA),检测220例2型糖尿病患者(T2DM组)和76例正常对照者(NC组)血浆中Klotho水平,并测定相关临床资料和生化指标,比较组间差异。使用美国GE公司的双能X线骨密度仪对159例T2DM患者进行骨密度测定,根据WH01994年推荐的骨质疏松标准将T2DM患者分为3个组：骨量正常(BMD0)组77例,骨量减少(BMD1)组59例,骨质疏松(OP)组23例,分析T2DM患者骨密度改变与Klotho水平的关系及其影响因素。结果①T2DM组血浆Klotho水平低于NC组(4.92±0.47vs5.38±0.60,P<0.01),协方差分析后Klotho水平仍存在组间差异(P<0.01)；②多元逐步回归分析显示,胰岛素敏感指数(ISI)和血肌酐(Scr)是Klotho水平的独立相关因素(B分别为2.743、-0.004,P均<0.05)；③BMDO组、BMD1组和OP组间血浆Klotho水平比较无统计学差异(4.95±0.48vs4.96±0.47vs4.91±0.49,P>0.05)；④第1、2、3、4腰椎、腰椎均值、股骨颈、股骨大粗隆和全身均值骨密度与血浆Klotho水平均无相关性(P均>0.05)；⑤Logistic回归分析显示,年龄、DM病程、HDL-CIBMI是影响T2DM患者骨密度改变的独立相关因素(B分别为0.037、0.005、-1.011、-0.175,OR分别为1.038、1.005、0.364、0.84)。结论(1)T2DM患者血浆Klotho水平降低,其水平与胰岛素敏感指数独立相关,血浆Klotho水平可能是一个反映患者胰岛素抵抗及T2DM发生的监测指标。(2)T2DM患者骨密度下降及骨质疏松可能与血浆Klotho水平无相关性,而年龄和DM病程是其危险因素,HDL-C和BMI是其保护因素。
