ASPH促进肝纤维化发生发展的作用与机制研究

研究背景及目的肝细胞癌（以下简称肝癌）是原发性肝癌中最常见的形式,发病率居全球癌症第六位,且全球超过一半的肝癌患病人群来自中国。肝癌通常预后极差,为癌症相关死亡的第三大主要原因。大多数肝癌在慢性肝炎引起的严重肝纤维化和肝硬化基础上发展而来。慢性肝炎病毒感染、酒精性肝病以及肝脏脂肪变性是肝硬化和肝癌的主要危险因素。由于肝癌发生的风险与肝脏疾病的背景因素密切相关,而肝纤维化则是肝脏疾病的主要病因之一,因此对于肝纤维化和肝癌发生发展机制的研究十分必要。天冬氨酰β-羟化酶（Aspartateβ-hydroxylase,ASPH）是一种α-酮戊二酸依赖性的双加氧酶,其发现源于有乙肝病史的肝细胞癌患者细胞系（FOCUS）,可特异催化体内某些蛋白质中存在的表皮生长因子样结构域（Epidermal growth factor-like domain）中天冬氨酸或天冬酰胺残基上β碳原子的羟化反应,并发挥其生物学功能。现阶段关于ASPH的研究表明,ASPH在小细胞肺癌、结肠癌、恶性胶质瘤、肝细胞癌、胆管癌及胰腺癌患者的肿瘤组织中呈现高表达趋势,并能够影响肿瘤细胞的迁移能力和疾病进展。本课题组亦发现,ASPH的表达量增高与肝细胞癌的肿瘤进展和临床预后较差相关。同时,有研究发现ASPH通过糖原合成激酶3β调控细胞衰老从而促进肝癌的发生发展。然而,现阶段ASPH的研究主要集中在其他恶性肿瘤领域和肝癌的临床和细胞层面,而在肝纤维化领域及肝癌的动物模型和尚无系统性的研究。前期工作中,本课题组发现肝癌患者的肿瘤组织中ASPH的表达量显著高于癌旁组织,且肝纤维化组织中ASPH的表达亦显著高于正常肝组织。同时,在二乙基亚硝胺（DEN）诱导的小鼠肝癌模型和四氯化碳（CCl4）诱导的小鼠肝纤维化模型中也观察到实验组小鼠的ASPH表达量相较对照组显著升高。因此,研究ASPH在肝癌和肝纤维化中的作用及其分子机制将有助于全面系统的认识该分子的生物学功能,并为ASPH这一分子靶点在肝病治疗中的临床转化奠定基础。研究方法1.利用临床组织样本研究ASPH和肝纤维化及肝癌的关系:结合课题组已有的肝癌中ASPH表达水平和患者预后数据,利用定量PCR检测患者肝纤维化组织和正常肝组织中ASPH的表达水平,用ASPH的抗体进行免疫组化染色,在蛋白水平上检测肝纤维化组织和对照肝组织中的ASPH表达,研究ASPH和肝纤维化及肝癌的关系。进一步将组织按照纤维化严重程度进行评分（Ishak评分系统）,研究ASPH表达和肝纤维化程度的相关性。肝星形细胞（HSCs）是肝纤维化的主要效应细胞,我们通过免疫组化染色检测组织中HSC活化的指标,如CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、α-SMA和TGF-β1。同时采用免疫荧光法对组织进行α-SMA和ASPH的特异染色,以明确ASPH在HSC中的特异表达情况。2.利用小鼠疾病模型研究ASPH和肝纤维化及肝癌的关系:根据文献报道方法,我们通过小鼠腹腔注射四氯化碳（CCl4）和胆总管结扎分别诱导两种肝纤维化模型,并通过腹腔注射二乙基亚硝胺（DEN）和四氯化碳（CCl4）诱导肝癌模型。同时,我们利用CRISPR/Cas9技术针对ASPH的His-2区域23外显子进行敲除,成功建立了ASPH基因敲除(ASPH-/-)小鼠,通过肝组织染色比较敲除小鼠和野生型小鼠中肝纤维化和肝癌的组织病理变化,并在对ASPH敲除小鼠和野生型小鼠的肝纤维化和肝癌组织进行差异基因表达分析,用基因芯片技术检测mRNA的变化,寻找差异表达的关键分子。同时,为了检测抑制ASPH的功能是否影响小鼠肝纤维化和肝癌的发生和进展,我们在模型过程中同时给予小鼠注射ASPH的小分子抑制剂MO-I-1100,以验证ASPH能否作为肝纤维化和肝癌治疗的潜在靶点。3.利用肝星形细胞系研究ASPH对肝星形细胞活化和肝纤维化的影响:我们在HSC系Lx2中过表达ASPH,利用针对ASPH活性位点构建的慢病毒特异性地敲除ASPH,并通过WB检测ASPH的过表达和敲除水平,分析过表达和敲除ASPH后对肝星形细胞增殖、凋亡、迁移的影响。同时检测其对细胞的活化指标CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2、α-SMA和TGF-β1表达的影响。4.统计学方法:数据结果均以均数±标准差(（?）±s)表示。多组间差异比较可采用One-way ANOVA法分析,Graphpad Prism 5.0软件用于数据统计分析和制图。将P<0.05定义为差异有统计学意义。研究结果1.本研究共收集34例肝纤维化组织样本和36例正常肝组织样本。相比于正常组织,肝纤维化组织中ASPH的表达显著上升,进一步将肝纤维化组织评分发现,ASPH表达和肝纤维化程度呈线性正相关关系。2.CCl4或BDL诱导的肝纤维化模型以及DEN和CCL4诱导的肝癌模型均构建成功。在两种模型中,野生型小鼠肝脏组织中ASPH表达水平均明显高于对照组和假手术组。同时,ASPH-/-小鼠的肝硬化程度轻于野生型,表现为汇管区胶原沉积减少,纤维化指数较低,且肝脏组织中α-SMA、CollagenαⅠ、TIMP-1、MMP-2和TGF-β1的表达水平较野生型小鼠组明显降低;类似地,ASPH-/-小鼠诱发肝癌的直径大小、数量均显著低于野生型小鼠。3.利用小干扰RNA（siRNA）下调HSC中ASPH的表达或使用ASPH抑制剂（MO-I-1100）后,HSC细胞的增殖、迁移受到显著抑制,且肝纤维化效应分子表达显著降低。基因芯片检测发现,具有肝纤维化表型的野生型与ASPH-/-小鼠相比,共有86个基因表达升高,259个基因表达降低,其中Cyp4a14基因差异倍数最大。选取Cyp4a14基因和通路验证后发现,ASPH-/-小鼠中Cyp4a14显著下调。通过siRNA下调HSC中Cyp4A14的表达后,HSC增殖、迁移均受到显著抑制,且HSC活化的效应分子CollagenαⅠ和α-SMA的表达亦显著降低。结论ASPH在肝纤维化患者和小鼠中表达升高,ASPH敲除后小鼠肝纤维化和肝癌的严重程度减轻。抑制ASPH时HSC的活化程度减低。Cyp4a14可能作为ASPH的下游分子,直接或通过视黄醇代谢通路参与HSC的活化。因此我们推断,ASPH可以通过Cyp4a14/视黄醇代谢通路促进HSC活化从而促进肝纤维化的发生与发展。