痛泻要方对慢性应激导致的内脏高敏感和肠道动力异常的作用及机制研究

目的：1.观察慢性避水应激模型大鼠的生物学行为特征并初步探讨该模型的生物学基础；2.观察皮质酮(CORT)在慢性避水应激导致的内脏高敏感和肠道动力异常中的作用并初步探讨其作用机制；3.观察痛泻要方对应激模型鼠的内脏高敏感、肠道动力异常以及其他生物学行为的影响,并初步探讨其中的作用机制。方法：1.1)建立慢性避水应激模型；2)观察大鼠体重增长情况；3)对大鼠进行结直肠扩张(colorectal distension, CRD)导致的腹部回缩反射(abdominal withdrawal reflex, AWR)行为学评分并测量行为学为3分时的内脏痛觉阈值以评价其内脏敏感性；4)观察大鼠大便性状并统计应激状态下和基础状态下平均1小时的排便粒数以评价其肠道转运能力；5)进行糖水偏爱实验和旷场实验以评价大鼠的抑郁和焦虑状态；6)对大鼠结肠进行HE染色观察其病理学改变；7)运用Elisa法检测大鼠血浆皮质酮(CORT)水平并测量肾上腺占体重比重,以此评价其下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)的活性；8)运用Elisa法检测大鼠血浆相关神经递质(5-HT、SP、VIP、NO)水平以评价其内分泌基础；9)运用甲苯胺蓝染色法对结肠肥大细胞进行染色并计数。2.1)复制慢性避水应激大鼠模型,设立正常对照组、模型组以及CORT受体阻断剂RU-486组；2)评价各组内脏敏感性、肠道转运能力、焦虑和抑郁行为；3)运用Elisa法测定各组大鼠血浆CORT水平并测量肾上腺/体重比值；4)运用RT-PCR检测各组L6-S2DRG中内源性大麻素受体1(CB1)和瞬时受体电位香草酸亚型1(TRPV1)的mRNA表达水平,western-blot检测各组L6-S2DRG中CB1和RPV1蛋白表达情况。3.1)复制慢性避水应激大鼠模型,设立正常对照组、模型组、痛泻要方高剂量组、痛泻要方中剂量组以及痛泻要方低剂量组；2)比较各组间：体重增长情况、内脏敏感性、肠道转运能力、抑郁和焦虑样行为；3)评价各组大鼠HPA轴活性、相关神经递质水平(血浆5-HT、SP、NO水平)；4)RT-PCR检测各组大鼠L6-S2DRG中CB1和TRPV1mRNA表达水平,Western-blot检测各组大鼠L6-S2DRG中CB1和TRPV1蛋白表达水平；5)甲苯胺蓝法对各组大鼠结肠组织肥大细胞进行染色并计数。结果：1.慢性避水应激模型组大鼠与对照组大鼠相比：1)体重增加明显减少；2)存在内脏敏感性增加的表现(AWR评分明显增加、3分行为学时的内脏痛觉阈值明显降低)；3)肠道转运能力明显增强(应激状态以及基础状态下排便粒数明显增多)；4)存在类似抑郁和焦虑的精神活动异常状态(糖水偏爱比明显下降,在旷场箱中的探究行为明显减少)；5)结肠HE染色未见明显的病理学损害；6)HPA轴活性增加(血浆CORT水平明显上升、肾上腺/体重比值明显增加)；7)血浆5-HT、SP水平上升,NO水平下降,而VIP水平未见明显改变；8)结肠组织的肥大细胞数目明显增加。2.1)RU-486能明显改善慢性应激模型鼠的内脏高敏感状态；2)RU-486能明显降低模型鼠的肠道转运能力；3)RU-486在一定程度上改善模型鼠的抑郁和焦虑状态；4)慢性避水应激模型鼠存在明显的HPA轴活性增加,而RU-486在对模型鼠生物学行为改善的同时伴随着对HPA轴活性的调节作用；5)慢性避水应激模型鼠L6-S2 DRG中的CB1mRNA和蛋白水平明显减少,而TRPV1mRNA和蛋白水平明显增加；6)RU-486可以明显增加模型鼠L6-S2 DRG中CB1mRNA和蛋白水平并降低TRPV1mRNA和蛋白水平。3.1)痛泻要方可以改善慢性避水应激模型鼠的内脏高敏感性和肠道高转运状态,并有一定的抗抑郁和焦虑作用,同时伴随内脏高敏感和肠道动力异常等症状的该善,其体重增长情况也有所好转；2)痛泻要方可以调节HPA轴活性(降低血浆CORT水平及肾上腺／体重比值)、调节神经递质分泌(降低血浆5-HT和SP水平、升高NO水平)、提高L6-S2DRG中C B1mRNA和蛋白表达水平、降低L6-S2DRG中TRPV1mRNA和蛋白表达水平、减少结肠肥大细胞数。结论：1.慢性避水应激模型能模拟临床上IBS的内脏高敏感和肠道动力异常改变,可以用于BS相关的内脏感觉和肠道动力异常的研究；其中,HPA轴活性增加、相关神经递质分泌异常、结肠肥大细胞数增加是该模型的部分生物学基础。2.慢性避水应激导致的内脏痛觉过敏以及肠道高转运状态与L6-S2DRG中CB1(下调)和TRPV1(上调)表达异常密切相关,且这一改变可能是通过CORT介导的。慢性避水应激导致的模型鼠HPA轴过度兴奋可能参与了模型鼠焦虑和抑郁情绪的形成,进而在一定程度上影响了模型鼠的肠道症状。3.痛泻要方对慢性应激模型鼠的内脏高敏感和肠道动力异常具有明显的改善作用,其中调节内分泌、结肠肥大细胞数、HPA轴兴奋性进而调控DRG中与肠道感觉和动力相关的分子CB1和TRPV1的表达可能是其内在的作用机制。这将为其在临床上治疗IBS提供一定的理论依据,具有重要的临床价值和理论价值。