线粒体钙单向转运体在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中的作用及机制研究

研究背景:颅内动脉瘤破裂导致的自发性蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是神经外科最常见的脑血管疾病,具有较高的死亡率及致残率,对社会及家庭造成较重的负担。既往研究主要集中于SAH后脑血管痉挛(cerebral vasospasm,CVS)及可能由CVS导致的脑缺血性损伤,近期的临床试验表明,SAH后CVS的有效控制并不能改善患者预后。越来越多的研究表明SAH后早期(24-72小时内)脑损伤(early brain injury,EBI)与SAH患者的预后密切相关,并起决定性作用。大量证据表明EBI病理生理机制复杂,多种因素参与其中,包括氧化应激、钙超载、铁累积、炎性反应和凋亡等。线粒体钙单向转运体(mitochondrial calcium uniporter,MCU)位于线粒体内膜上,在生理条件下,介导线粒体钙吸收。钌红(ruthenium red,RR),钌360等可结合MCU的钙离子结合位点,从而起抑制MCU的作用,包括精胺在内的多胺类化合物可以激活MCU的吸收过程。SAH后细胞内钙超载、铁累积已被大量实验所证明,尼莫地平(一种钙通道阻滞剂)已被临床试验证明具有脑保护作用并能有效改善SAH患者预后,动物实验中运用铁螯合剂亦具有明显的脑保护作用。继发于细胞钙超载的线粒体钙超载可导致细胞内大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生,激活线粒体凋亡信号通路,导致脑损伤。进入线粒体的亚铁离子可与活性氧发生芬顿反应,产生活性最强的羟自由基,进一步加重SAH后脑组织的氧化应激损伤。近年,已有研究表明,抑制MCU可减轻缺血/再灌注或者高铁所致的脑和心脏的损伤。故本实验主要研究抑制MCU是否能对SAH后的早期脑损伤起保护作用,并研究相关机制。目的:(1)建立稳定的大鼠视交叉池单次自体股动脉血注射的SAH模型;(2)验证抑制MCU对SAH后钙超载及脑损伤的作用;(3)验证抑制MCU对SAH后铁代谢异常的作用。方法:使用大鼠视交叉池单次自体股动脉血注射法建立稳定的SAH模型。Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为四组:对照组,SAH组,SAH+钌红组,SAH+精胺组。SAH模型建立后,使用钌红(2.5 mg/kg)生理盐水溶液或精胺(5 mg/kg)生理盐水于大鼠SAH后腹腔注射治疗;动物处死前进行行为学评分;取新鲜脑组织测定SAH后脑组织ROS、ATP、组织及线粒体内钙离子含量;Western blot法检测对应脑组织内凋亡、铁调节相关蛋白表达;TUNEL染色法展示神经细胞凋亡,并用尼氏染色法显示脑损伤程度;顺乌头酸酶活性检测检测SAH后颞叶皮层顺乌头酸酶活性。结果:各实验组模型在SAH后取脑时均被确定有效。检测结果表明较对照组,大鼠SAH后脑组织及线粒体内钙含量明显增加(P<0.05),脑组织铁累积明显(P<0.05);ROS生成升高(P<0.05),顺乌头酸酶活性明显降低(P<0.05),ATP含量明显减少;Westernblot检测显示SAH后线粒体细胞色素c明显向胞质转移(P<0.05),凋亡相关蛋白caspase-3含量明显增多(P<0.05),铁调控蛋白提示细胞铁累积(P<0.05);同时,TUNEL染色、尼氏染色显示明显的神经细胞凋亡和脑损伤(P<0.05)。SAH后予以抑制MCU可明显减轻脑组织钙超载及铁累积,减少氧化应激,改善细胞能量供应,减少凋亡相关蛋白表达,明显缓解早期脑损伤(P<0.05)。结论:我们发现大鼠SAH后EBI明确发生,且SAH后早期的钙超载及铁累积导致的氧化应激反应在SAH后EBI中起重要作用。抑制MCU能够减轻SAH后钙超载及铁累积,减少ROS生成并改善脑组织能量供应,从而有效缓解神经细胞凋亡和脑损伤。以上结果提示MCU是SAH病人的一个潜在治疗靶点。