菊花多糖的分离纯化、结构鉴定及其生物活性研究

菊花系菊科植物菊(Chrysanthemum morifolium Ramat.)的干燥头状花序,是一味药食同源的,具有悠久药用历史的清热解毒中草药。中医药理论认为,菊花具有散风清热、平肝明目的功效,主要用于头痛眩晕、眼目昏花、目赤肿痛、风热感冒等症。药理学研究已经证实菊花具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种生物功能。但目前对菊花化学成分和药理作用的研究多集中于黄酮、黄酮苷、萜类(特别是挥发油)和微量元素等小分子化合物,而对菊花中多糖等大分子化合物鲜有相关深入报道。菊花在临床中多以水煎剂入药,多糖作为其中的重要成分之一,其化学结构和药理活性有待于深入研究,从而能合理的开发和利用菊花多糖,促进更好的发挥菊花的药用价值。为此,我们对菊花中的多糖进行了提取、分离纯化、结构鉴定和衍生物的制备(如硫酸化、羧甲基化等),并通过免疫模型、抗氧化模型以及抗血管生成模型对其生物活性进行了探讨。本课题采用3.8 kg干燥的怀菊花药材,分别经过沸水提取和5%的氢氧化钠提取乙醇沉淀法,获得了沸水提取粗多糖CMJA(295 g,产率7.8%)和碱提取粗多糖JHB(96 g,产率2.5%)。粗多糖CMJA经DEAE-纤维素阴离子交换树脂和凝胶渗透色谱Sephacryl S-300 HR分离纯化获得了八种均一多糖组分,分别为:CMJA0S1(110 mg,产率0.4%),CMJA0S2(616 mg,产率2.2%),CMJA1a S2(650 mg,产率2.3%),CMJA1a S3(104 mg,产率0.4%),CMJA1b S2(150mg,产率0.5%),CMJA1b S3(550 mg,产率2.0%),CMJA2S2(570 mg,产率2.0%)和CMJA2S3(610 mg,产率2.2%)。粗多糖JHB经DEAE-纤维素阴离子交换树脂和凝胶渗透色谱Sephacryl S-200 HR分离纯化获得了均一多糖组分JHB0S2(532 mg,产率1.9%)。经过单糖组成分析、甲基化GC-MS分析、部分酸水解等化学方法以及IR、NMR等光谱学方法,对这些多糖的一级结构进行了研究。结果表明,CMJA0S1是一种分子量为4.7×104Da的阿拉伯半乳聚糖。CMJA0S2的分子量为6.5×103Da,主链为由1,4-β-Glcp,1,4-β-Galp,1,4-β-Manp组成的半乳甘露葡聚糖,并具有1,6-β-Galp,T-α-Glcp,T-α-Araf,1,5-α-Araf等构成的支链。CMJA1a S2,CMJA1a S3,CMJA1b S2,CMJA1b S3和CMJA2S2是一系列不同分子量的RG-I型果胶多糖,它们的半乳糖醛酸含量和支链糖基组成各有不同,以1,2-α-Rhap和1,4-α-Gal Ap组成主链,并且在鼠李糖的O-4位具有阿拉伯糖、半乳糖等构成的支链。CMJA2S3是分子量为1.1×104 Da,由半乳糖醛酸组成的HG型果胶多糖。JHB0S2是分子量为1.6×104 Da的木葡聚糖,以1,4-β-Glcp构成主链,在O-6位有分支,连接木糖残基。基于NF-κB的免疫激活测试表明,菊花多糖能激活核转录因子NF-κB,具有较强的免疫活性。采用DPPH自由基清除实验和对H2O2诱导的PC12细胞凋亡的保护作用实验证明了菊花多糖具有抗氧化活性。尤其以半乳甘露葡聚糖为主链的CMJA0S2的抗氧化作用最强,当浓度为1.0 mg/ml时,DPPH自由基清除率和PC12细胞存活率分别高达81%和98%。此外,通过HMEC-1细胞抗血管生成模型测试,揭示了木葡聚糖JHB0S2以及采用氯磺酸吡啶法制得的硫酸化衍生物JHB0S2-sul可以明显的抑制HMEC-1细胞管腔的形成,具有抗血管生成活性。这些结果说明菊花多糖作为菊花的重要成分之一,在免疫调节、抗氧化保护以及抗血管生成方面具有显著的生物活性。通过本课题的研究,可以为合理的开发、利用菊花多糖以及寻求其保健功能、药用价值,提供有效的科学依据。