血浆长链非编码RNAs作为系统性红斑狼疮生物标志物的分子流行病学研究

背景系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）具有复杂的遗传背景,涉及编码基因和非编码基因,过去普遍认为编码基因在疾病的发生发展中起重要作用,但很少关注基因组中的非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）。按长度大小,具有调控作用的nc RNA主要分为两类:≤200 nt的短链非编码RNA(主要为微小RNA（micro RNA,简称mi RNA）)和>200 nt的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lnc RNA）。大量研究表明mi RNA在SLE的发病过程中发挥着关键作用,可作为一种新型生物标志物用于SLE的诊断和预后评估。与mi RNA相比,lnc RNA的种类繁多且数量庞大,能够从表观遗传水平、转录水平、转录后水平和蛋白质代谢等多个层面调控基因表达。Lnc RNA在人类多种疾病的发生发展过程中也起着非常重要的调控作用。新近研究表明,在SLE患者外周血单核细胞中,linc0949（ENST00000500949）和NEAT1（nuclear enriched abundant transcript 1）的表达水平明显异常,且与疾病活动度和肾脏受累有关,NEAT1通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）通路,促进相关趋化因子和炎症因子的表达,进而参与SLE的发病过程。由于SLE临床表现复杂多样,病情反复多变,早期诊断困难,因此迫切需要寻求一种新型、特异性及敏感性较高的生物标志物用于SLE的诊断和预后评估。研究证实lnc RNA在血浆中稳定存在,可作为肿瘤和心血管疾病的早期生物标志物和治疗靶点,用于疾病的早期筛查、诊断和预后评估。然而目前,关于lnc RNA在SLE患者中的研究还很有限,且探讨血浆lnc RNA作为SLE疾病易感性标志物的研究尚未见报道。目的筛选在SLE患者血浆中异常表达的lnc RNAs,并进行独立验证,评估差异血浆lnc RNAs作为SLE辅助诊断的生物标志物的价值;利用生物信息学分析,对差异lnc RNAs进行功能预测,探讨其在SLE发病中的作用机制。方法本研究共分为两部分:第一部分:SLE患者血浆差异lnc RNAs的筛选、验证及作为生物标志物的价值本部分采用的是四阶段病例-对照设计:第一阶段:收集新发SLE非肾炎患者、新发狼疮肾炎（lupus nephritis,LN）患者和正常对照血浆各12例,各组每4例血浆总RNA等量混合,即形成每组各3份血浆总RNA池。利用lnc RNA芯片检测血浆lnc RNA表达谱,筛选差异lnc RNAs。第二阶段:小样本初步验证,在原单个血浆标本中,采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR）技术,对从芯片中筛选出的10个候选差异lnc RNAs和根据文献挑选的5个候选lnc RNAs（ENST00000500597:linc0597;ENST00000500949:linc0949;ENST00000449289:GAS5或lnc9289;ENST00000587298:lnc-DC;ENST00000495032:HOTAIRM1）的表达水平进行初步验证。第三阶段:大样本独立验证,另收集240例SLE患者和120例正常对照的血浆标本,随机分为训练组（SLE患者160例,正常对照80例）和测试组（SLE患者80例,正常对照40例）。首先,在训练组中,采用q RT-PCR技术检测从小样本初步验证中得到的差异lnc RNAs;然后,在测试组中,应用q RT-PCR技术对从训练组中验证出的差异lnc RNAs给予进一步验证;最后,在240例SLE患者中,探讨最终验证出的差异lnc RNAs与主要临床指标的关联性。此外,为了评价血浆差异lnc RNAs单个或组合作为SLE生物标志物的价值,我们首先采用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线分析各单个差异lnc RNAs的诊断价值,然后基于训练组,应用logistic回归分析构建预测SLE风险的lnc RNAs联合判别模型,并在训练组和测试组中,采用ROC曲线分析探讨其联合诊断价值。最后,我们在240例SLE患者中,按照有无肾炎将SLE患者分为LN组和SLE非肾炎组,应用logistic回归分析构建预测LN风险的lnc RNAs联合判别模型,采用ROC曲线分析探讨血浆差异lnc RNAs单个或组合作为鉴别LN和SLE非肾炎生物标志物的价值。第四阶段:应用q RT-PCR技术检测差异lnc RNAs在疾病对照组(类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者30例,原发性干燥综合征（primary Sjogren's syndrome,p SS）患者31例)血浆中的表达情况,评估差异lnc RNAs作为SLE生物标志物的特异性,并采用ROC曲线分析对联合判别模型的诊断价值给予进一步验证。第二部分:SLE相关m RNAs及lnc RNAs的生物信息学研究对lnc RNA芯片建立的SLE患者血浆m RNA差异表达谱,进行基因本体论（gene ontology,GO）和KEGG生物学途径（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway）分析;同时结合q RT-PCR验证结果,建立差异lnc RNA-m RNA共表达网络分析;采用竞争性内源RNA（competitive endogenous RNA,ce RNA）分析,构建m RNA-mi RNA-lnc RNA调控网络,探寻可作为ce RNA的lnc RNA。结果第一部分:SLE患者血浆差异lnc RNAs的筛选、验证及作为生物标志物的价值本研究通过lnc RNA芯片建立了SLE非肾炎和LN的血浆lnc RNA和m RNA差异表达谱（差异倍数≥2倍,P≤0.05）,从中筛选出10个候选血浆差异表达lnc RNAs,并结合文献挑选的5个候选lnc RNAs进行小样本初步验证。小样本初步验证发现,与正常对照相比,在SLE患者血浆中15个候选lnc RNAs（ENST00000450640:lnc0640;ENST00000583643:lnc3643;ENST00000584688:lnc4688;ENST00000425150:lnc5150;ENST00000506655:lnc6655;NR027074:lnc7074;ENST00000507514:lnc7514;ENST00000458228:lnc8228;ENST00000519603:lnc9603;uc001agf.1:lncagf.1;GAS5;linc0597;linc0949;lnc-DC;HOTAIRM1）中共有9个lnc RNAs（GAS5,linc0597,lnc0640,lnc5150,lnc3643,lnc6655,lnc7074,lnc7514,lncagf.1）的表达水平存在显著变化（均有P<0.05）。大样本独立验证进一步确定了在训练组和测试组的血浆样本中,linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074的表达水平均显著变化（均有P<0.05）。且在训练组和测试组中,LN患者与SLE非肾炎患者比较,lnc7074、lnc3643、lnc0640、lnc7514和lnc6655的表达水平均显著上调（均有P<0.05）。关联性研究结果显示血浆linc0597和GAS5的表达水平与C3水平均呈显著负相关（分别为P<0.001和P=0.009）;lnc5150的表达水平与血小板减少和C3水平显著相关（分别为P=0.008和P=0.001）;lnc0640的表达水平与低补体、血小板减少和C3水平显著相关（分别为P=0.001、P=0.017和P<0.001）;lnc7074的表达水平与血小板减少和C3水平显著相关（分别为P=0.028和P<0.001）。在训练组中,血浆linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074作为SLE生物标志物的ROC曲线下面积（area under the curve,AUC）分别为0.634、0.824、0.598、0.625和0.602,5个lnc RNAs组合预测SLE风险的判别公式为logit（P=SLE）=-2.594+7.503×linc0597-14.253×GAS5+2.853×lnc5150-7.012×lnc7074+6.233×lnc0640,AUC为0.966。在测试组中,血浆linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074作为SLE生物标志物的AUC分别为0.649、0.851、0.615、0.683和0.662,联合判别模型的AUC为0.968。与测试组SLE患者相比,在RA患者的血浆中,GAS5和linc0597的表达水平均显著上调（均有P<0.05）;在p SS患者的血浆中,GAS5和lnc7074的表达水平均显著上调（均有P<0.05）。在测试组SLE患者和RA患者中,联合判别模型的AUC为0.683;在测试组SLE患者和p SS患者中,联合判别模型的AUC为0.910;在测试组SLE患者和RA患者+p SS患者中,联合判别模型的AUC为0.798。在240例SLE患者中,肾炎组和非肾炎组相比,血浆lnc0640、lnc3643、lnc5150、lnc6655、lnc7074和lnc7514的表达水平均显著上调（均有P<0.05）。lnc0640、lnc3643、lnc5150、lnc6655、lnc7074和lnc7514用于鉴别LN和SLE非肾炎的AUC分别为0.644、0.671、0.601、0.631、0.665和0.684;lnc3643、lnc5150和lnc7514可联合作为鉴别LN和SLE非肾炎的生物标志物,3个lnc RNAs预测LN风险的联合判别公式为logit（P=LN）=-0.139+1.387×lnc3643-2.048×lnc5150+1.647×lnc7514,AUC为0.716。第二部分:SLE相关m RNAs及lnc RNAs的生物信息学研究GO分析结果显示,在SLE患者下调的血浆m RNAs中,“ion homeostasis”、“cation transmembrane transporter activity”和“plasma membrane part”分别在生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和细胞组分（cellular component,CC）中富集程度最高;在SLE患者上调的血浆m RNAs中,“cell-cell signaling”、“anion:cation symporter activity”和“cell periphery”分别在BP、MF和CC中富集程度最高。KEGG Pathway分析结果显示,在SLE患者下调的血浆m RNAs中,“axon guidance-Homo sapiens（human）”通路富集程度最高;在SLE患者上调的血浆m RNAs中,“MAPK signaling pathway-Homo sapiens（human）”通路富集程度最高。Lnc RNA-m RNA共表达网络分析结果显示,GAS5、lnc0640、lnc5150、lnc7074、lnc3643、lnc6655和lnc7514分别与174、18、48、30、36、28和20个m RNAs有较一致的表达模式（Pearson相关系数≥0.935）。其中,DUSP4（dual specificity phosphatase 4）、ARRB2（arrestin beta 2）和RPS6KA5（ribosomal protein S6 kinase A5）可能分别是GAS5、lnc0640和lnc5150正向调控的靶基因,GAS5、lnc0640和lnc5150可能均通过MAPK通路参与SLE的发病过程;C4orf26（chromosome 4open reading frame 26）可能为lnc0640、lnc5150、lnc6655和lnc7074共同作用的靶基因;PARP16(poly（ADP-ribose）polymerase family member 16)可能为lnc3643、lnc5150、lnc6655和lnc7074共同作用的靶基因。Ce RNA分析结果显示,GAS5、lnc0640、lnc3643、lnc6655和lnc7074可作为ce RNA与预测靶基因竞争靶向mi RNAs,进而影响靶向mi RNAs对其预测靶基因的调控。结论1.与正常对照相比,SLE患者血浆中GAS5和lnc7074表达水平显著下调,linc0597、lnc0640和lnc5150表达水平显著上调;SLE患者血浆中linc0597和GAS5的表达水平显著低于RA患者,GAS5和lnc7074的表达水平显著低于p SS患者;2.血浆linc0597、GAS5、lnc0640、lnc5150和lnc7074联合有望作为SLE潜在的生物标志物;lnc3643、lnc5150和lnc7514联合有望作为鉴别LN和SLE非肾炎潜在的生物标志物;3.GAS5、lnc0640和lnc5150可能通过MAPK通路参与SLE的发病过程;4.GAS5、lnc0640、lnc3643、lnc6655和lnc7074可能作为ce RNA,影响靶向mi RNAs对其预测靶基因的调控。