双水相萃取白蛋白和酶的初步研究

蛋白质和酶在人类日常生活、疾病预防和治疗以及工业生产中都发挥着重要的作用,其提取分离是获取这类物质的必要手段。目前,工业上粗分离蛋白质的主要方法有盐析法、等电点沉淀法和有机溶剂沉淀法。虽然这几种方法都能在一定程度上达到分离的目的,但仍然存在诸多缺点,如操作步骤繁琐,对操作条件要求苛刻,而且分离过程中容易发生蛋白质变性,蛋白分离提取的收率和效率较低。针对这些问题,本论文提出了采用低分子量亲水有机溶剂/无机盐的新型双水相体系对蛋白质进行分离提取。 首先,考察了多种单羟基的短链醇/无机盐双水相体系对牛血清白蛋白的萃取能力。结果表明,多种体系对白蛋白都有较好的萃取效果。综合考虑成本、工业可行性、萃取效果,选取了磷酸氢二钾/乙醇和碳酸钠/乙醇体系做进一步的研究。在磷酸氢二钾18%(w/w)/乙醇18%(w/w)、碳酸钠13%(w/w)/乙醇18%(w/w)时,白蛋白收率达到最大分别为94.0%、93.6%,此时的白蛋白分配系数为11.52、11.24,这与传统的低分子量聚乙二醇/磷酸氢二钾体系萃取效果相似。 其次,采用萃取能力较强、且受温度和pH影响较小的磷酸氢二钾/乙醇体系对发酵液和牛血液中的白蛋白进行分离提取。在发酵液处理方面,首先考察了对0.2L发酵液的萃取能力,在磷酸氢二钾20%(w/w)/乙醇18%(w/w)时白蛋白回收率和菌体去除率高达93.5%和99.8%;进一步做了放大实验,考察了此体系对2L、23L、50L、73L的发酵液的处理能力,得到的白蛋白收率依次为106.3%、113.2%、98.3%和96.7%;将处理后的上相调节pH4.5后依次过高盐阳离子、疏水和阴离子柱层析进行纯化,纯化后的白蛋白在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上得到了单一条带,经HPLC分析结果显示纯度为99.71%。当牛血液稀释倍数为9、磷酸氢二钾18%(w/w)和乙醇15%(w/w)时,84.41%的白蛋白被萃取到了上相,而IgG和杂蛋白则大部分被沉淀到了两相界面处,达到了一个较为理想的分离提取效果。 最后,采用二元醇/无机盐双水相体系对蛋白质进行分离提取。考察了该体系对白蛋白和多种酶的萃取分离效果,结果白蛋白在保持二级结构不变得前提下,蛋白收率和纯度高达91.1%和85.5%;几种酶都得到了较高的酶比活性保留率和蛋白回收率,分别在83%和73%以上。 实验表明,低分子量的亲水有机溶剂/无机盐体系较适合于蛋白质和酶的分离提取,具有良好的应用前景。