Tim-3对炎性肠病的调节作用及机制研究

Tim-3对炎性肠病的调节作用及机制研究 背景 T细胞免疫球蛋白及粘蛋白分子-3（T cell Immunoglobulin domain and Mucindomain protein-3,Tim-3）是一种最初发现于活化的Th1细胞表面的共刺激分子,在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白（Tim）家族成员。Tim-3分子在维护体内免疫平衡稳定中起重要作用。现已知半乳糖结合蛋白-9（Galectin-9,Gal-9）为Tim-3的天然配体,该分子广泛表达于外周免疫系统,而其长片断的Gal-9亚型分子则特异性表达在肠粘膜及相关淋巴组织,二者均可与Th1细胞上的Tim-3分子特异性结合,引发Th1细胞死亡,下调Th1型免疫反应,诱导免疫耐受。目前已明确Tim-3分子通过调节不同CD4+T效应细胞亚群的功能广泛参与了自身免疫病、移植排斥、抗感染等免疫应答过程。而Tim-3是否参与了炎性肠病（InflammatoryBowel Diseases,IBD）的发生,在炎性肠病中起到什么样的作用目前还不清楚。 目的 探讨Tim-3分子对炎性肠病的调节作用及机制。 方法 利用分子生物学技术克隆Tim-3胞外段基因,构建含有小鼠Tim-3胞外段基因的Tim-3pET32a（+）重组质粒,转化表达菌株E.coli BL-21（DE3）感受态细胞,诱导表达目的蛋白,用镍柱亲和纯化目的蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot方法验证目的蛋白的纯度和特异性。通过直肠灌注三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS）的方法建立炎性肠病小鼠模型—TNBS-结肠炎,从体重、死亡情况,结肠大体及组织学改变和细胞因子变化等方面对模型进行评价。在TNBS-结肠炎小鼠的基础上腹腔注射Tim-3蛋白,从体重、死亡情况,结肠大体及组织学改变等方面观察Tim-3蛋白对结肠炎小鼠的影响。通过ELISA检测IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-23、TGF-β水平的变化,通过FACS检测小鼠外周血中Tim-3+细胞的表达和小鼠脾细胞、肠系膜淋巴结中Treg细胞的表达及共刺激分子CD28、CD80、CD86、CTLA-4的表达,通过Real-time PCR法检测小鼠脾细胞和淋巴结细胞中Tim-3和Foxp3的表达。 结果 成功克隆了小鼠Tim-3基因及其胞外段基因片段;实现了小鼠Tim-3分子的可溶性原核表达。成功建立了炎性肠病小鼠模型,表现在建模后小鼠出现松毛、精神萎靡、少食、腹泻、体重下降、死亡等症状;结肠缩短、肠壁增厚,水肿、炎性渗出,呈节段性炎性改变;结肠发生透壁性炎症,肠壁结构破坏,大量炎性细胞浸润;IFN-γ水平升高、IL-4水平降低,IL-17水平升高,小鼠出现Th1、Th17细胞偏移;前炎性因子TNF-α、IL-6水平明显升高。在TNBS-结肠炎建模前12hr腹腔注射Tim-3蛋白能够明显加重小鼠结肠炎症状,表现在小鼠体重明显下降和死亡率明显增加,结肠大体标本和组织切片结果均提示结肠炎小鼠病理损伤进一步加重,并且结肠炎症状与小鼠体内Tim-3+细胞数目成正相关;前炎性因子IFN-γ、IL-17、IL-23水平明显升高,而抗炎性因子IL-4、TGF-β水平明显下降;经典的Treg细胞群即表达CD25、Foxp3的CD4+T细胞数目减少;肠系膜淋巴结细胞CD80的表达水平下降,同时CD4+T细胞CTLA-4的表达降低而CD28的表达升高。 结论 Tim-3分子可能通过对共刺激分子CD28、CD80、CTLA-4的调节,影响CD4+T效应细胞不同亚群的极化,发挥对炎性肠病的负调节作用。