DNA聚合酶β、GST-π基因表达的调控对食管癌细胞耐药性的作用

食管癌是中国（尤其河南省林州市及辉县）最常见的恶性肿瘤之一，该地区食管癌的发病率、死亡率均极高。化疗是食管癌主要的临床治疗手段之一，然而肿瘤细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）现象的产生常影响化疗药物的疗效，MDR是导致肿瘤化疗失败的主要原因，资料表明，90％以上肿瘤患者的死因与MDR有关。MDR指的是肿瘤细胞在接触某一种化疗药物后，不仅对此种药物产生耐受性，而且对其它的结构和功能不同的多种药物也产生交叉耐受性。MDR是恶性肿瘤难治和复发的重要原因之一，是肿瘤细胞在生存压力之下建立起来的一种适应过程。肿瘤细胞可以通过多种机制产生MDR，如细胞膜上表达的药物排流泵通过泵机制把药物从细胞内排出细胞外、细胞解毒能力的增强（如谷胱甘肽转移酶GST-π）、DNA修复能力的增强（如DNA聚合酶β）、药物靶蛋白（如拓扑异构酶TopoⅡ）量或活性的改变、蛋白激酶C各种同工酶活性和表达水平的改变等。不同肿瘤细胞可通过不同的途径导致MDR的发生，一种肿瘤细胞可同时存在多种耐药机制。 因此体外建立食管癌耐药细胞系，筛查食管癌耐药相关基因，从基因表达水平寻找在耐药产生中具有关键作用的分子改变，对于全面了解肿瘤细胞的耐药机制，寻找逆转药物耐受的分子靶点具有重要的理论和现实意义。 本研究首先用食管癌细胞EC9706作为亲本细胞诱导建立耐药细胞系EC9706／cDDP。在此基础上，用RT-PCR方法筛选食管癌耐药相关基因，之后选取polβ、GST-π基因进一步研究其与食管癌耐药的相关性。通过调控其表达水平观察对食管癌细胞耐药性的作用，即分别构建这2个基因的真核表达载体，转染入EC9706细胞，初步观察其生物学效应，尤其对耐药指数的影响；并构建靶向这2个基因的siRNA重组慢病毒，探讨其体外对食管癌细胞耐药性逆转的效果以及在裸鼠体内逆转移植瘤耐药性的效果。 论文分4部分： 第一部分人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706／cDDP的建立及相关耐药基因的筛选 方法：采用顺铂（cDDP）中等浓度、间歇作用方法历时9个月建立耐药细胞系EC9706／cDDP，光学显微镜观察耐药细胞的形态学特点；MTT法测定其对cDDP、5-FU、长春新碱、紫杉醇的敏感性，观察冻存、撤药对耐药性的影响；比较耐药与亲本细胞生长曲线、群体倍增时间、贴壁率的不同；流式细胞仪测细胞周期；软琼脂实验测细胞的恶性增殖能力；罗丹明摄入／排出实验测定P-gp功能；RT-PCR半定量方法测定亲本细胞及耐药细胞耐药相关基因如DNA聚合酶（polβ）、多药耐药相关基因（MRP）、谷胱甘肽转移酶-π（GST-π）、二氢叶酸还原酶（DHFR）、拓扑异构酶（TopoⅡ）和多药耐药基因（mdr1）等基因的mRNA表达水平。 结果：人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706／cDDP在形态学上与亲本细胞无明显差别，但对cDDP的敏感性降低，耐药指数为15.7，同时对未接触过的5-FU、长春新碱、紫杉醇等有交叉耐药性，耐药指数分别为：3.2、2.8、1.8。冻存对耐药性影响不大，撤药培养可使细胞耐药性降低，耐药细胞群体倍增时间延长（29.79±0.48h vs 25.79±0.45h），生长缓慢，G0／G1、S期细胞比例增加，克隆形成率明显高于亲本细胞，二种细胞对罗丹明摄入／排出的差异无统计学意义。polβ、DHFR、GST-π基因mRNA的表达比亲本细胞显著增加（P＜0.05），TopoⅡ的表达降低（P＜0.05），而mdr1、MRP表达的增加无显著统计学意义（P＞0.05）。 第二部分polβ、GST-π真核表达载体的构建及转染EC9706细胞的生物学效应研究 方法： 1．设计带有接头的GST-π全cDNA引物，提取EC9706细胞mRNA，RT-PCR扩增出GST-π全基因，插入T载体，进行序列分析，亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中。 2．设计带有接头的polβ全cDNA引物，从野生型polβ的重组质粒pcDNA3.1-polβ中扩增出polβ的放阅读框序列，插入T载体，亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中。 3．将构建好的2种重组载体脂质体转染法分别导入EC9706细胞，G418筛选获得分别稳定高表达GST-π、polβ的EC9706细胞。细胞形态学观察、生长曲线测定，用半定量RT-PCR和Western-blot测定转染细胞GST-π、polβ的表达，MTT法测细胞对顺铂敏感性的变化，双层软琼脂试验检测细胞恶性程度。 结果： 1．分别构建了GST-π真核表达载体（pIRES2-AcGFP1-GST-π）和polβ真核表达载体（pIRES2-AcGFP1-polβ）。分别转染EC9706细胞后在荧光显微镜下可发出绿色荧光，经筛选得到分别高表达GST-π、野生型polβ的EC9706细胞，转染前后细胞形态没有明显改变。 2．转染pIRES2-AcGFP1-GST-π的细胞中GST-πmRNA的相对表达水平（2.34±0.12）比未转染细胞（0.94±0.14）明显增加（P＜0.05）。GST-π蛋白的相对表达水平比未转染细胞明显增加。对cDDP的耐药指数为2.36。 3．转染pIRES2-AcGFP1-polβ的细胞中polβmRNA的相对表达水平（1.21±0.15）比未转染细胞（0.52±0.13）明显增加（P＜0.05）。polβ蛋白的相对表达水平比未转染细胞明显增加。对cDDP的耐药指数为1.78。双层软琼脂试验结果，EC9706-polβ细胞的集落生成率为57％，与EC9706（24％）及空质粒对照EC9706-KC（26％）的集落生成率相比差异有统计学意义（P＜0.05）。 第三部分靶向GST-π、polβ的siRNA慢病毒的构建及其对EC9706／cDDP细胞耐药性的逆转 方法：设计分别靶向GST-π、polβ的编码短发夹RNA的DNA单链模板各2对，退火后定向克隆入慢病毒载体pRNAT-U6.2／Lenti，PCR筛选阳性克隆，测序鉴定得到靶向GST-π、polβ的siRNA慢病毒表达载体：GSTsi1、GSTsi2、polsi1、polsi2。用293FT细胞包装病毒，收集病毒液，以细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。分别感染EC9706／cDDP细胞，RT-PCR、Western blot测感染细胞中GST-π、polβ的表达；MTT法测细胞对顺铂敏感性的变化；免疫荧光实验观察重组慢病毒的干扰效果。 结果： 1．分别构建了靶向GST-π（GSTsi1、GSTsi2）和靶向polβ（polsi1、polsi2）的siRNA慢病毒表达载体，病毒滴度达1.8-2.3×10～7 CFU／ml。感染后的EC9706／cDDP细胞在荧光显微镜下可发出绿色荧光，感染效率高。 2．感染GSTsi1、GSTsi2的细胞中GST-πmRNA的相对表达水平为：0.27±0.03、0.12±0.02，与未感染细胞（0.91±0.03）相比显著降低（P＜0.05），分别下调了70.3％和86.8％；而且细胞中GST-π蛋白表达也显著降低，对cDDP的耐药指数为9.59；免疫荧光结果表明感染GSTsi2的细胞发红色荧光的数目少且荧光较弱。 3．感染polsi1、polsi2的细胞中polβmRNA相对表达水平为0.09±0.02、0.28±0.05，分别下调90.2％和54.8％，比未感染细胞（0.62±0.03）显著降低（P＜0.05）；而且细胞中polβ蛋白表达量也显著降低；对cDDP的耐药指数为13.9；免疫荧光结果表明感染polsi1的细胞发红色荧光的数目少且荧光较弱。 第四部分裸鼠荷瘤试验 方法： 1．用EC9706和EC9706／cDDP细胞通过皮下注射的方法建立2种裸鼠移植瘤模型，观察成瘤时间。当移植瘤的直径约5mm时，开始治疗试验。 2．荷瘤裸鼠EC9706 4只，瘤体内多点注射cDDP（200μg／ml，0.1ml，每3天1次，连续4次）。 3．16只荷瘤裸鼠EC9706／cDDP，随机分成4组：PBS组、cDDP（200μg／ml）组、cDDP+GSTsi2慢病毒组（200μg／ml cDDP与靶向GST-π的慢病毒液等量混匀）、cDDP+polsi1慢病毒组（200μg／ml cDDP与靶向polβ的慢病毒液等量混匀）。分别在瘤体内多点注射各0.1ml，每3天1次，连续4次，定期观察肿瘤大小。 4．治疗结束后处死各组裸鼠，取出移植瘤组织，测量体积。 结果： 1．EC9706和EC9706／cDDP二组细胞均具有裸鼠体内成瘤的活性，种植后均可于实验8d左右肉眼观察到皮下移植瘤生成，成瘤率达100％。12d瘤体直径可达4～5mm左右。EC9706和EC9706／cDDP二组细胞平均成瘤时间无明显差异（P＞0.05）分别为7.75±0.96d、8.00±0.82d。 2．结束治疗时EC9706组和EC9706／cDDP组肿瘤体积分别为610.00±35.59mm3和990.00±99.33mm3，差异性有统计学意义（P＜0.05）。 3．PBS组、cDDP组裸鼠移植瘤体积在治疗过程中均继续增加，化疗结束后平均体积分别为：1124.00±25.13mm3、990.00±99.33mm3，二者无显著性差异（P＞0.05）。cDDP+GSTsi2慢病毒组肿瘤体积增长缓慢，治疗后肿瘤平均体积为747.50±72.30mm3，与PBS组、cDDP组间移植瘤体积具有显著性差异（P＜0.05）；而cDDP+polsi1慢病毒组（937.50±118.70mm3）与PBS组、cDDP组间移植瘤体积无显著性差异（P＞0.05）。 结论： 1．建立了人食管鳞癌顺铂耐药细胞系EC9706／cDDP，且耐药性稳定，为耐药机制及耐药逆转研究提供实验模型。其耐药性的产生与polβ、GST-π、DHFR、TopoⅡ等基因的异常表达有较高相关性，而与mdr1、MRP表达的相关性不明显； 2．GST-π表达的增加可导致食管癌细胞对化疗药顺铂敏感性的降低：用RNAi技术沉默GST-π的表达可一定程度逆转食管癌细胞的顺铂耐药性； 3．polβ的表达增加可导致食管癌细胞对化疗药顺铂敏感性的降低及细胞恶性表型的增加；用RNAi技术沉默polβ的表达可一定程度逆转食管癌细胞的顺铂耐药性； 4．分别用EC9706和EC9706／cDDP构建了荷瘤裸鼠，EC9706／cDDP具有较高的体内顺铂耐药性； 5．运用靶向GST-π的高滴度重组慢病毒合并cDDP瘤体内多点注射，可有效逆转移植瘤细胞耐药表型，化疗效果明显；而靶向polβ的高滴度重组慢病毒合并cDDP瘤体内多点注射，对移植瘤化疗效果不明显。