TSC1/TSC2调控人胚肺成纤维细胞HELF增殖及分化的研究

肺纤维化(pulmonary fibrosis, PF)是受多种因素调控的肺间质失常造成的,如肺部肿瘤的放疗与化疗等。肺纤维化的发生特别受大量细胞因子的影响。肺成纤维细胞在肺部结构与功能的形成与维持上有重要的作用。目前针对肺纤维化的治疗以糖皮质激素、细胞毒性药物为主要药物,但是效果不是很良好,副作用多。探讨肺纤维化的发病机制。研究治疗肺纤维化的可能的新靶点,是国内外药物研究的趋势。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一种丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶,可以接受多种信号通路的信号刺激,激活转录并能促进细胞的生长与增殖。多篇文献报道,负调控mTOR可以负性调控纤维化。位于mTOR信号通路的上游的TSC1-TSC2肿瘤抑制因子,在基因表达正常的情况下可以负性调控哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶,阻断该信号通路。TSC1的基因定位9q34.3, TSC2的基因定位于16P13.3[4,5],分别编码错构素及结节素。文献报道高水平的结节素可以负调控细胞增殖,并且低水平的结节素会加快细胞的增殖。错构素也可以负调控细胞增殖。最近研究发现,活化的雷帕霉素靶蛋白激酶信号通路可以促进肾成纤维细胞的激活,并且敲除TSC1基因的转基因小鼠可以显示出肾间质纤维细胞的激活以及肾纤维化。那么TSC1、TSC2是否可以抑制纤维化?本文主旨就在探讨TSC1、TSC2在肺纤维化疾病中的角色。本实验通过观察TSC1、TSC2对HELF细胞的增殖及转分化的影响,并探讨其潜在的作用机制。主要研究内容总结如下：1. TSC1、TSC2在HELF细胞中的基因产物的表达本实验通过Western blot法检测采用TGF-β1刺激细胞HELF后TSC1、TSC2的基因产物表达情况。结果显示,TGF-β1刺激组中TSC1、TSC2的表达明显低于正常组。2.过表达TSC1、TSC2对HELF细胞增殖及分化的作用结果显示,转染pcDNA3-HA3-TSC1可以增加TSC1在HELF中的表达,进一步研究pcDNA3-HA3-TSC1对HELF周期的影响,pcDNA3-HA3-TSC1可通过促使细胞阻滞于G0/G1期,G2/M期及S期细胞比例降低,影响HELF细胞的增殖。同时,pcDNA3-HA3-TSC1可以降低HELF中a-SMA、Collagen I蛋白的表达水平。表明上调TSC1的表达可负调控HELF的增殖与分化。进一步研究pcDNA3-FLAG-TSC2对HELF周期的影响,结果显示,pcDNA3-FLAG-TSC2可通过促使细胞阻滞于G0/G1期,G2/M期及S期细胞比例降低,负调控HELF细胞的增殖。同时,pcDNA3-FLAG-TSC2可以降低HELF中a-SMA、Collagen I蛋白的表达水平。表明上调TSC2的表达可负调控HELF的增殖与分化。3. HELF中TSC1、TSC2基因甲基化程度采取焦磷酸测序(Pyrosequencing)的方法用于探讨HELF细胞中TSC1、TSC2基因的甲基化程度。TGF-β1刺激组的TSC1基因的3个检测位点的甲基化程度均要高于正常组。TGF-β1刺激组的TSC2基因的6个检测位点中的5个的甲基化程度要高于正常组。5-azadC对HELF细胞的作用被检测,Western blot结果显示2μg/m 15-azadC明显上调了由TGF-β1引起的TSC1、TSC2降低的表达。4. MeCP2对HELF中TSC1、TSC2的影响Western blot检测TGF-β1刺激的HELF中MeCP2蛋白表达随着时间的增进而升高。给予TGF-β1体外诱导肺纤维化模型,再在HELF细胞中转染siRNA-MeCP2, Western blot检测结果显示MeCP2、a-SMA及Collagen I蛋白表达均受siRNA-MeCP2抑制,同时TSC1、TSC2基因产物的蛋白表达水平较TGF-p1组升高。体外诱导肺纤维化模型,再在HELF细胞中转染pEGFP-C2-MeCP2, Western blot检测结果显示MeCP2、a-SMA及Collagen I蛋白表达均上调。同时TSC1、TSC2基因产物蛋白表达水平较TGF-β1组较低。以上结果表明上调TSC1/TSC2基因产物表达可以抑制HELF的增殖与分化,对肺纤维化具有一定的保护作用,其在TGF-P刺激的HELF中表达低的机制可能与DNA甲基化相关。