基于肠道菌群调控FXR/FGF15/FGFR4通路探讨胆囊胆固醇结石湿热证的分子生物学机制

目的本研究采用“致石饲料+内湿+外湿”的方法建立胆囊胆固醇结石(Cholesterol gallstones,CS)湿热证小鼠模型,从方证对应的角度给予加减大柴胡汤进行干预,从肠道菌群紊乱引起胆固醇-胆汁酸代谢异常探讨CS湿热证的分子生物学机制,为CS湿热证的客观化研究与临床诊疗提供新切入点与科学依据。方法1.采用高胆固醇致石饲料诱发法复制CS动物模型。54只6周龄SPF级C57BL/6J雄性小鼠,按照体重随机分组分区法分为空白组15只、造模组39只。空白组小鼠食用普通饲料,给予造模组小鼠高胆固醇致石饲料;造模9周后,两组随机各选3只小鼠取材,查看其胆囊结石情况,判断CS模型是否成功。造模成功后,再次按照体重随机分组分区法将造模组小鼠随机均等分为模型组、加减大柴胡汤组、熊去氧胆酸组,每组各12只。2.采用“内湿+外湿”法建立湿热证动物模型,即“致石饲料+内湿+外湿”的方法建立CS湿热证小鼠模型。在造模第10～13周时,空白组小鼠仍延续先前的饲养模式,模型组、加减大柴胡汤组和熊去氧胆酸组3组小鼠在全天候食用高胆固醇致石饲料的基础上,置于人工气候箱模拟的外湿热环境下(温度32±1℃、湿度95%)10h/d,在处于湿热环境的同时给予20%蔗糖水饮用,其余时间换为正常饮用水。造模前后均要观察记录小鼠的一般情况并进行旷场行为学实验。造模第14～17周,在造模条件不变的前提下,加减大柴胡汤组和熊去氧胆酸组小鼠给予相应的药物干预,空白组与模型组则给予等剂量灌胃生理盐水。干预后,对各组小鼠取材,以备后续相关指标的检测。3.HE染色法观察各组小鼠肝脏、回肠、舌组织的形态学差异。4.NPP底物-AMP缓冲液法、GCNA底物法与钒盐酸氧化法分别检测血清ALP、GGT、TBIL含量。5.ELISA法检测各组小鼠胆汁TC、TBA的含量。6.16Sr DNA扩增测序法检测各组小鼠肠道菌群生物多样性。7.q-PCR法和Western Blot法分别检测小鼠回肠组织中FXR、FGF15和肝脏组织中FGFR4、ERK1/2、JNK的m RNA表达水平与蛋白表达水平。结果1.一般情况:空白组小鼠精神状态良好,好攀爬、活跃程度高,皮毛致密、柔顺、光亮,体重呈整体平稳增加趋势,饮食状况良好,二便正常。模型组、加减大柴胡汤组与熊去氧胆酸组小鼠在造模1～9周时,体重增长幅度明显高于空白组,饮食量较空白组增多;造模10～13周时,体重增长幅度则低于空白组,饮食量减少,毛发油亮稀疏,嗜卧懒动,眵多,精神不振,小便色黄,大便稀软,出现明显的湿热证候表现。第17周结束后,模型组、熊去氧胆酸组小鼠状态较先前差别不大;加减大柴胡汤组小鼠,精神状态较好,常在笼中四散活动,皮毛粗糙但致密,眵少,小便正常,大便时干时稀,体重与模型组、熊去氧胆酸组比显著回升(P<0.01),饮食量较先前增多,湿热证候改善。2.旷场行为学实验:造模前各组小鼠旷场行为学实验中水平穿越格子数、直立次数和静止时间方面均无明显差异(P>0.05)。造模13周结束后,与空白组相比,模型组小鼠水平穿越格子数和直立次数显著减少(P<0.01),静止时间明显延长(P<0.05)。干预治疗后,与空白组相比,模型组小鼠的水平穿越格子数和直立次数仍显著降低(P<0.01)、静止时间仍显著延长(P<0.01)。与模型组相比,加减大柴胡汤组干预后,水平穿越格子数显著增多(P<0.01),直立次数明显增加(P<0.05),静止时间显著缩短(P<0.01)。与熊去氧胆酸组比,加减大柴胡汤组干预后,水平穿越格子数和直立次数显著增多(P<0.01)、静止时间明显缩短(P<0.05)。3.胆囊结石状况:与空白组相比,模型组小鼠胆囊明显增大,胆汁呈黄褐色浑浊状态,有少量泥沙样物质沉淀;加减大柴胡汤组小鼠和熊去氧胆酸组小鼠胆汁浑浊情况较模型组有不同程度减轻。4.血清ALP、GGT、TBIL含量:与空白组比,模型组小鼠血清ALP、GGT、TBIL含量均显著升高(P<0.01)。与模型组相比,加减大柴胡汤组和熊去氧胆酸组小鼠血清ALP、GGT、TBIL含量均显著降低(P<0.01)。与熊去氧胆酸组相比,加减大柴胡汤组小鼠血清ALP、TBIL含量均显著降低(P<0.01)。5.胆汁TC、TBA含量:与空白组相比,模型组小鼠胆汁内TC含量增高显著(P<0.01)、TBA含量降低显著(P<0.01);与模型组相比,加减大柴胡汤组和熊去氧胆酸组小鼠胆汁内TC含量均显著降低(P<0.01)、TBA含量均显著增高(P<0.01);与熊去氧胆酸组小鼠相比,加减大柴胡汤组小鼠胆汁内TC含量显著减少(P<0.01)、TBA含量显著增多(P<0.01)。6.肠道菌群生物多样性:(1)与空白组相比,模型组小鼠肠道菌群丰富度(Chao1、Observed species)、多样性(Shannon、Simpson)与均匀度(Pielou＿e)均显著降低(P<0.01);与模型组相比,加减大柴胡汤组小鼠丰富度(Chao1、Observed species)、多样性(Shannon、Simpson)与均匀度(Pielou＿e)均有上调趋势(P>0.05)。(2)Beta多样性及门、属水平菌群物种组成分析结果显示,除模型组与熊去氧胆酸组间菌群差异不明显(P>0.05),其他各组件组间差异显著(P<0.01)。(3)4组小鼠在界、门、纲、目、科、属分类学水平总共有66个显著差异菌(LDA阈值>3),其中属水平有25个。空白组包括Bacteroides、Gelidibacter、Thalassospira、Blautia等9个差异菌属;Melissococcus为模型组显著差异菌属;加减大柴胡汤组显著差异菌属有11个,包括Aerococcus、Candidatus＿Arthromitus、Lactobacillus等;熊去氧胆酸组有Chitinophaga、Kurthia、Vagococcus、Weissella4个显著差异菌属。7.回肠FXR、FGF15与肝脏FGFR4、ERK1/2、JNK的m RNA与蛋白表达情况:(1)FXR:与空白组相比,模型组小鼠回肠FXR的m RNA与蛋白表达均呈显著升高趋势(P<0.01);与模型组相比,加减大柴胡汤组小鼠回肠FXR的m RNA与蛋白表达显著下降(P<0.01),熊去氧胆酸组小鼠回肠FXR的m RNA表达明显下降(P<0.05);与熊去氧胆酸组相比,加减大柴胡汤组小鼠回肠FXR的蛋白表达明显降低(P<0.05)。(2)FGF15:与空白组相比,模型组小鼠回肠FGF15的m RNA表达显著增加(P<0.01)、蛋白表达明显增多(P<0.05);与模型组相比,加减大柴胡汤组小鼠回肠FGF15的m RNA表达明显减少(P<0.05)。(3)FGFR4:与空白组相比,模型组小鼠肝脏FGFR4的m RNA与蛋白表达均明显增多(P<0.05);与模型组和熊去氧胆酸组相比,加减大柴胡汤组小鼠肝脏FGFR4的m RNA表达均明显降低(P<0.05)。(4)ERK1/2:与空白组相比,模型组小鼠肝脏ERK1/2的m RNA(P<0.01)与蛋白表达均明显增多(P<0.05);与模型组相比,加减大柴胡汤组与熊去氧胆酸组小鼠肝脏ERK1/2的m RNA表达显著降低(P<0.01)、蛋白表达呈下降趋势(P>0.05)。(5)JNK:与空白组相比,模型组小鼠肝脏JNK的m RNA与蛋白表达均显著增多(P<0.01);大柴胡汤组小鼠肝脏JNK的m RNA表达显著降低(P<0.01),p-JNK蛋白表达明显降低(P<0.05)。8.有差异菌属与胆固醇-胆汁酸代谢相关指标的相关性研究:库特氏菌属(Kurthia)、气球菌属(Aerococcus)、魏斯氏菌属(Weissella)和蜜蜂球菌属(Melissococcus)与FXR、FGF15、FGFR4、ERK1/2、JNK的表达具有显著正相关性(P<0.01);FXR、FGF15、FGFR4、ERK1/2、JNK的表达与Alistipes属和普雷沃菌属(Prevotella)、粪球菌属(Coprococcus)和巴恩斯氏菌(Barnesiella)呈明显负相关(P<0.01、P<0.05)。结论1.肠道菌群紊乱导致FXR/FGF15/FGFR4通路表达异常是CS湿热证的分子生物学机制之一。2.加减大柴胡汤可通过调整肠道菌群紊乱,调控FXR/FGF15/FGFR4通路相关因子的表达,调节胆固醇-胆汁酸代谢,改善肝功能及胆汁成分异常,发挥清热祛湿、消石利胆之效。