基于血脑屏障Claudins基因调控的冰片、麝香酮“开窍”机制研究及安全性评价

目的：研究中药开窍药冰片和麝香酮对斑马鱼血脑屏障超微结构及其紧密连接蛋白Claudins表达的影响，以阐明冰片和麝香酮开启血脑屏障的机制。利用斑马鱼胚胎对冰片和麝香酮的安全性进行评价。 方法：给成年斑马鱼腹腔注射麝香酮（给予冰片后血脑屏障超微结构的观察之前的研究者已做过），利用透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构的变化；实时荧光定量PCR和整体原位杂交技术探讨冰片和麝香酮对斑马鱼紧密连接蛋白Claudins表达的影响以及下调明显基因不同时间点表达的变化。受精后3h（3hpf）斑马鱼在含冰片和麝香酮不同浓度的胚胎养殖水液暴露，在8，24，48，72和96hpf用显微镜观察胚胎发育形态，测定24hpf自主抽动次数，48hpf心率、孵化率、畸形率和死亡率，RT-qPCR法检测96hpf胚胎sepn1基因表达的情况。 结果：在给予麝香酮后，BBB的基膜出现断裂，膨大的现象，紧密连接结构疏松，内皮细胞出现皱缩，随着给药时间的增长，BBB疏松越明显(与冰片结果一致)；冰片或麝香酮作用1h后，大部分基因表达下调，其中Claudin-5a，-12在冰片中下调明显，Claudin-2，-5a，-7b在麝香酮中下调明显。Claudin-5a在冰片作用后，1h下调最为明显，6h后表达恢复。麝香酮作用的4h之间，Claudin-2，-5a，-7b表达先短暂上调，后下调，1h下调最显著，然后又恢复，其中Claudin-5a在4h时恢复至正常水平。冰片和麝香酮对斑马鱼胚胎24hpf时自主抽动次数，48hpf心率，孵化率，畸形率，死亡率都存在不同程度的影响；48hpf以后都出现脊柱弯曲、心囊水肿、卵黄囊水肿，游泳异常的毒性症状；冰片使胚胎的sepn1基因表达上调（P<0.05）。麝香酮使sepn1基因表达明显下调（p<0.01）。 结论：冰片和麝香酮能使紧密连接蛋白Claudins家族基因表达下调，致使紧密连接结构疏松，加之基膜结构破坏，内皮细胞皱缩，使得血脑屏障的屏障作用减弱，从而开启血脑屏障。基因可逆性的下调说明冰片和麝香酮对BBB的开启是生理性的，对脑部不会带来病理学损伤。从用药安全性来看，高浓度的冰片和麝香酮对斑马鱼胚胎发育有明显毒性作用。