高效降解亚硝酸盐的芽孢杆菌LJ01的鉴定及其亚硝酸盐还原酶的表征

亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质,在蔬菜发酵过程中极易积累,给产品带来潜在的食品安全问题,且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症,因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。本实验从豆瓣酱中筛选鉴定出一株能高效降解亚硝酸盐的蜡样芽孢杆菌LJ01,同时研究了其亚硝酸盐还原酶的表征,具体结论为:首先综合其形态、生理生化特性以及16S r DNA基因序列分析,将LJ01鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)。菌株LJ01在对数期时降亚硝酸盐的速率较低,达到稳定期时降解速率达到最大,而后变缓。在24h内LJ01最大的NaNO2降解浓度为250μg/mL其降解率达到99.31%。采用铵态氮法和ECD-气相色谱法研究了LJ01在LB体系中降解亚硝酸盐的产物,经测定体系中N2O体积百分比含量分别为440.45×10-6和65.98×10-6,与对照组的N2O含量相比均有显著性(p≤0.05)。铵态氮实验表明,实验组与对照组中均无TAN产生。LJ01细胞内外组分的酶活结果表明LJ01降解亚硝酸盐是源于细胞内Ni R的作用。利用DEAE Sepharose Fast Flow交换层析和Sephadex G-150葡聚糖凝胶过滤层析对LJ01的粗酶液进行分离纯化,收集有NiR活性组分,经聚乙二醇20000浓缩后,进行SDS-PAGE测得其单体分子量约为30 ku。采用克隆表达技术提高NiR的量,构建重组质粒pET-32a(+)以及重组菌BL21重组菌经培养后,利用1 mM的IPTG进行诱导产酶,粗酶液经Ni亲和层析法和DEAE Sepharose Fast Flow交换层析进行纯化,得到了纯度较高的NiR。通过质谱、ICP-MS和圆二色谱等对其进行表征测定,结果为重组NiR的分子量为67 ku;该酶中同时存在铁离子和铜离子,且含量分别为51.0 mg/Kg和184.5 mg/Kg;圆二色谱结果显示α-螺旋结构在重组NiR中所占比例最大。