植物乳杆菌DMDL9010中亚硝酸盐还原酶的克隆表达、纯化及酶学性质

亚硝酸盐常作为食品添加剂、发色剂添加至腌制、发酵食品中,摄入过量亚硝酸盐会诱发高铁血红蛋白症,同时亚硝酸盐也是亚硝胺的前体物质,亚硝胺是一种强致癌物,可以诱发消化系统中的多种癌变,因此亚硝酸盐是一种潜在的致癌物,控制其在食品中的含量非常必要。而亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,简称NIR)能降解亚硝酸盐。在前期研究中,从中国泡菜中分离一株具有降解亚硝酸盐的乳酸菌,后鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DMDL9010。利用菌株DMDL 9010为基础,克隆其Ni R基因,并构建含有nir基因序列的原核重组表达菌株,利用IPTG诱导表达重组蛋白NIR(recombinant protein NIR,简称r NIR),再利用亲和层析分离纯化得到r NIR,并研究rNIR的部分酶学性质,主要结果为:首先查找植物乳杆菌的NIR蛋白序列,找到nir编码基因序列,大小为1638bp,根据该序列设计引物,以植物乳杆菌DMDL9010的全基因DNA作为模板,PCR扩增得到目的片段约1700 bp大小。将nir目的片段双酶切后定向的连接到p ET-32a(+)上,然后转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和双酶切验证重组质粒连接结果,从而获得成功构建重组质粒pET-32a(+)-nir。重组质粒pET-32a(+)-nir构建成功后,将其转化到表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中,在含Na NO2为50μg/m L的体系中工程菌p ET-32a(+)-nir-BL21能降解亚硝酸盐约45μg/m L。工程菌p ET-32a(+)-nir-BL21以接种量2%接种于液体LB培养基(含50μg/m L氨苄青霉素)中在37°C、180 rpm震荡发酵培养,当OD600≈0.5时,用终浓度为1 m M的IPTG在30°C下诱导培养4 h,利用超声破碎法离心收集得到工程菌的粗蛋白液,粗蛋白液经镍亲和层析法纯化后得到了纯度较高的rNIR,SDS-PAGE电泳检测得到大小约60 k D。纯化浓缩得到的rNIR自身无法降解Na NO2,仅在添加电子供体(细胞色素C或从蜡样芽孢杆菌或干酪乳杆菌鼠李糖亚种中分离纯化得到供体蛋白)后才有酶活,表明该酶要在电子供体存在的情况下才能有反应活性。rNIR酶促反应的最适电子供体是细胞色素C,在反应体系中的最适浓度为0.05 mg/m L,最适反应时间为24 h,其最佳反应温度为37°C,最适反应底物浓度为50 mg/L,最适缓冲液是HEPES缓冲液。