黄芩苷和栀子苷配伍抗脑缺血兴奋性氨基酸毒性损伤的作用机制研究

目的基于微透析、液质联用和基因芯片技术探讨黄芩苷、栀子苷（7:3）配伍（Baicalin and Geniposide,BC/GP）抗脑缺血兴奋性氨基酸毒性的作用机制,为BC/GP的临床应用和脑缺血兴奋性氨基酸毒性研究提供参考。方法1.采用微透析技术与液质联用技术探讨BC、GP配伍抗脑缺血作用的物质基础研究。（1）SD大鼠18只,体重（280±20）g,随机分为4组:对照组,BC和GP（7:3）配伍低剂量组(30 mg·kg-1),中剂量组(45 mg·kg-1)及高剂量组(60 mg·kg-1)。各组大鼠药连灌胃给续给药7天,采用线栓法建立脑缺血模型,然后利用微透析技术收集给药大鼠脑缺血前后海马部位的脑脊液。（2）建立药物和兴奋性氨基酸的HPLC-MS/MS方法学,进而对微透析样品进行检测,观察其在动物体内的变化规律,从而探讨药物抗兴奋性氨基酸毒性的物质基础。2.采用基因芯片技术从基因水平观察研究BC和GP抗脑缺血兴奋性毒性的机制。（1）SD雄性大鼠16只(体重（240±20）g,随机分为5组:假手术组、模型组（4只）、BC单药组、GP单药组及BC/GP（7:3）配伍(60 mg·kg-1)组。各组大鼠连续灌胃给药7天后,采用线栓法建立脑缺血模型,于8 h取大鼠左侧海马组织-80℃保存备用。（2）将海马组织进行抽提质检后,取质检合格的样品通过基因芯片技术检测大鼠缺血侧海马神经递质受体基因的变化,然后采用ΔΔCt方法对结果进行统计分析。结果1.对透析脑脊液进行液质联用检测时,仅检测到GP、谷氨酸和天冬氨酸三种化合物,并且线性关系良好,脑缺血后,GP浓度较缺血前高,一直持续120 min,随后逐渐下降,且具有明显的剂量依赖性。与低剂量组相比,高剂量组的AUC（0-t）、MRT（0-∞）、Cmax和t1/2z具有显著性差异（P<0.01）。与模型组相比,灌胃给药后,谷氨酸和天冬氨酸升高的幅度均有不同程度的降低,且中剂量组和高剂量组作用效果更明显。2.用PCR基因芯片检测神经递质受体基因信号通路中基因共89个。模型组与假手术组相比,|Fold Regulation|>1.5的基因有22个,其中差异具有统计学意义的有5个,包括Grin2c（2.9026）、Chrna7（-1.5877）、Tacr2（-1.7695）、Htr3a（-1.8172）和Grm6（-2.3527）。BC组与模型组相比,|Fold Regulation|>1.5的基因有5个,其中差异具有统计学意义的有2个,包括Brs3（1.797）和Grin2c（-1.7979）。GP组与模型组相比,|Fold Regulation|>1.5的基因有14个,其中差异具有统计学意义的有3个,包括Hcrtr2（-1.6584）、Sctr（-3.8524）和Grin2c（-4.8408）。配伍组与模型组相比,|Fold Regulation|>1.5的基因有5个,其中差异具有统计学意义的仅有Grin2c（-1.8436）1个。所有显著表达差异的基因中与抗脑缺血兴奋性氨基酸毒性相关的基因有Grin2c、Grm6、Brs3和Sctr,而药物能够进行调节的只有Grin2c、Brs3和Sctr三个基因。结论1.BC、GP配伍给药后,GP可以透过血脑屏障,同时还能够减少兴奋性氨基酸谷氨酸和天冬氨酸在海马的释放。2.BC、GP配伍可以下调谷氨酸受体Grin2c基因的表达,从而抑制兴奋性氨基酸与兴奋性氨基酸受体的相互作用,减轻兴奋性氨基酸的毒性作用。3.BC、GP配伍可能通过减少兴奋性氨基酸的释放和抑制兴奋性氨基酸受体表达等机制发挥脑保护作用。