养殖扇贝类立克次氏体和病毒性病原研究

2000-2002年，分别自青岛黄岛、青岛太平角、威海、莱州、日照和长岛6个养殖海区采集栉孔扇贝和海湾扇贝样品，利用电镜超薄切片、电镜负染、ELISA方法，对养殖扇贝发病死亡现象与病毒和类立克次体病原感染的关系进行了研究。结果表明： 1．电镜观察病毒粒子呈球形，直径120-170nm，核衣壳外包被一层膜，膜表面放射状纤突清晰可见，长约20nm左右。类立克次体(RLO)球形或椭圆形，直径300-500nm，两层膜包被，有胞壁，中心是电子密度高的核糖体颗粒。 细胞病理学观察发现，栉孔扇贝外套膜及肝胰腺是病毒感染最严重的器官，而海湾扇贝仅在外套膜中发现病毒。病毒在皮下肌细胞的细胞质中复制，造成的细胞超微结构变化主要包括，粗面内质网膜肿胀，细胞器崩解，线粒体解体变异而形成的“髓袢样”异常结构。对细胞核结构的损伤主要有核膜部分溶解、核孔消失、核周隙扩张及有的细胞核染色质凝聚。 2．流行病学的研究表明，海湾扇贝从稚贝期到养成期均携带有病毒和类立克次体，但病毒感染率和感染强度均维持在较低的水平，且未出现明显的涨落，这与海湾扇贝在养殖期间未出现大规模死亡的状况相一致，说明病毒和类立克次体不可能是造成海湾扇贝发病的病原。而栉孔扇贝在整个养殖期间，病毒感染率基本保持在80％-100％之间，感染强度在不同养殖季节变化极为明显，其中感染强度的高峰出现在栉孔扇贝大规模死亡的7、8月份。对人工感染的栉孔扇贝进行检测分析发现，病毒感染组濒死扇贝体内，病毒的感染率和感染强度与养殖栉孔扇贝大规模死亡时期极为相似。而在类立克次体感染组，栉孔扇贝感染率和感染强度均未见明显变化。这些结果表明，病毒可能是造成栉孔扇贝大规模死亡的直接病原体。综合对养殖海区各温度、盐度、溶解氧和pH值等主要环境因子季节性变化的分析结果，分析认为，24℃以上的高温是栉孔扇贝发病的重要诱因。 3．以患病栉孔扇贝组织中提纯的急性病毒性坏死症病毒作为免疫抗原，注射新西兰白兔制备出效价高达1：32000的多克隆抗体作为第一抗体，第二抗体为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG(IgG-HRP)，通过交叉稀释法确定抗原、一抗及二抗的最优反应条件，建立酶联免疫吸附分析(ELISA)方法体系，病毒检测灵敏度达30ng。 采用间接ELISA技术，通过对两个养殖海区三个完整的养殖周期以及多个养殖海区扇贝大规模死亡时期的栉孔扇贝感染病毒的情况进行检测分析，结果一致表明，7、8月份样品检测结果呈强阳性，检出阳性率为75％-95％，其它时期阳性率较低。结果与电镜负染技术检测结果均一致表明，7月下旬到8月中下旬是AVND病毒感染的高峰期。对不同贝龄栉孔扇贝感染病毒的情况进行ELISA检测的结果表明，稚贝期即已存在病毒的感染。三龄贝体内病毒感染强度比二龄贝有所下降，这可能说明三龄贝对病毒已具有一定的抗性。