洁泽1号对阴道上皮细胞抗白色念珠菌天然免疫相关因子影响的实验研究

第一部分：洁泽1号对人阴道上皮细胞抗白色念珠菌TLR2、MyD88mRNA影响的实验研究 目的： 观察中药复方洁泽1号及其主药有效成分小檗碱对永生化人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）天然免疫因子TLR2、MyD88mRNA的影响，探讨洁泽1号是否可能通过TLRs信号途径在人阴道上皮细胞抗白色念珠菌天然免疫中发挥作用，为明确洁泽1号预防和治疗外阴阴道假丝酵母菌病的机制提供进一步的实验依据。 方法： 设置空白对照组（单独培养的VK2/E6E7）、白色念珠菌热灭活孢子与VK2/E6E7共培养（比例为10:1）各时间段组（1h，3h，6h，12h，24h，48h）。提取各组细胞总RNA，实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)检测细胞TLR2、MyD88mRNA的表达。 药物预防实验：设置空白对照组，模型组（VK2/E6E7与白色念珠菌共孵育），细胞+洁泽1号+白色念珠菌组、细胞+小檗碱+白色念珠菌组、细胞+甘露聚糖+白色念珠菌组（药物与细胞共孵育后，再加入白色念珠菌共培养）。 药物治疗实验：设置空白对照组，模型组（白色念珠菌与VK2/E6E7共孵育），细胞+白色念珠菌+洁泽1号组、细胞+白色念珠菌+小檗碱组、细胞+白色念珠菌+甘露聚糖组（白色念珠菌与细胞共孵育后，再加入药物）。 MTT法检测最低无细胞毒药物浓度。各组细胞培养相应时间后，吸弃细胞上清液，提取细胞总RNA，通过实时定量PCR检测各组细胞中TLR2、MyD88mRNA的表达。 结果： 1.实时定量PCR各组Ct值表明，人阴道上皮细胞VK2/E6E7中构成性表达TLR2、MyD88mRNA。白色念菌热灭活孢子与VK2/E6E7共培养后，TLR2、MyD88mRNA表达量呈升高趋势。共培养12h时，细胞TLR2、MyD88mRNA的表达量最高，与空白对照组相比统计学具有极显著性差异（P<0.01）；24h后，表达量开始下降。而24h MyD88mRNA表达量与空白对照组相比，仍具有显著性差异（P<0.05）。 2.洁泽1号、小檗碱、甘露聚糖对VK2/E6E7细胞的毒性实验：MTT法检测药物细胞毒性：洁泽1号对VK2/E6E7的IC10为14.7033mg/ml，作用时间为24小时；小檗碱对VK2/E6E7的IC10为6.1645μmol/L，作用时间为12小时；甘露聚糖对VK2/E6E7的IC10为24.1823mg/ml，作用时间为2小时。 3.洁泽1号、小檗碱、甘露聚糖对VK2/E6E7细胞TLR2、MyD88的影响：预防实验：与空白对照组相比，模型组细胞TLR、MyD88mRNA表达升高，差异统计学有极显著意义（P<0.01）；与模型组相比，洁泽1号和小檗碱预防组各因子mRNA表达量均明显降低（P<0.01），洁泽1号组与小檗碱组组间相比无明显差异；甘露聚糖预防组TLR2、MyD88表达亦降低（P<0.01），（P<0.05）。治疗实验：与模型组相比，洁泽1号组TLR2、MyD88亦升高（P<0.01），（P<0.05）；小檗碱组TLR2、MyD88表达均升高（P<0.05）；甘露聚糖组各因子变化无统计学意义（P＞0.05）。 结论： 人阴道上皮细胞VK2/E6E7中构成性表达TLR2、MyD88mRNA。白色念珠菌热灭活孢子与细胞共培养一定时间后，TLR2的表达明显升高；其下游因子MyD88的表达量也有升高趋势，说明白色念珠菌热灭活孢子可被VK2表面TLR2识别，并启动下游因子，可能通过MyD88依赖性途径介导天然免疫反应。TLR2在人阴道上皮细胞识别白色念珠菌并启动宿主免疫防御中起一定作用。洁泽1号预处理细胞后，能显著抑制天然免疫因子TLR2、MyD88的表达，限制局部炎症反应；而对于已感染白色念珠菌的细胞，洁泽1号能在感染早期促进细胞的天然免疫功能，此功能可能是通过TLR2-MyD88依赖性途径实现。 第二部分：洁泽1号对人阴道上皮细胞抗白色念珠菌HBD-2及IL-8、IL-1β影响的实验研究 目的： 观察中药复方洁泽1号及其主药有效成分小檗碱对永生化人阴道上皮细胞（VK2/E6E7）HBD-2mRNA及IL-8、IL-1β蛋白表达的影响，探讨洁泽1号在抗白色念珠菌感染时，是否通过影响细胞分泌表达炎性因子的能力来抵御感染，为明确洁泽1号预防和治疗外阴阴道假丝酵母菌病的机制提供进一步的实验依据。 方法： HBD-2预防与治疗实验分组和实验方法：同第一部分。 IL-8、IL-1β实验分组：预防实验：设置空白对照组，模型组（VK2/E6E7与白色念珠菌共孵育），细胞+洁泽1号组、细胞+小檗碱组（仅用药物处理细胞），细胞+洁泽1号+白色念珠菌组、细胞+小檗碱+白色念珠菌组（药物与细胞共孵育后，再加入白色念珠菌共培养）。治疗实验：设置空白对照组，模型组（白色念珠菌与细胞共孵育），细胞+白色念珠菌+洁泽1号组、细胞+白色念珠菌+小檗碱组（白色念珠菌与细胞共孵育后，再加入药物）。 IL-8、IL-1β实验方法：各组细胞加入相应药物或菌共孵育一定时间，再直接加入相应数量的白色念珠菌或相应浓度的药物继续共孵育，提取上清液，ELISA检测各组细胞上清液中IL-8、IL-1β的含量。结果： 1.洁泽1号、小檗碱、甘露聚糖对VK2/E6E7HBD-2表达的影响：与空白对照组相比，模型组HBD-2表达量升高（P<0.01），与模型组相比，洁泽1号、小檗碱、甘露聚糖预防组HBD-2表达量降低，其差异统计学有极显著意义（P<0.01）。与模型组相比，洁泽1号治疗组HBD-2表达升高（P<0.05），而小檗碱、甘露聚糖组HBD-2表达量降低（P<0.01）。 2.洁泽1号、小檗碱对VK2/E6E7细胞分泌IL-8、IL-1β的影响：预防实验：与空白对照组相比，模型组IL-8表达降低，其差别统计学有极显著意义（P <0.01），洁泽1号组IL-8表达无明显变化，小檗碱组IL-8降低（P <0.01）；与模型组相比，洁泽1号及小檗碱预防组IL-8表达量均升高（P <0.01）；洁泽1号预防组与洁泽1号组相比，IL-8表达量下降（P <0.01）；小檗碱预防组较小檗碱组相比，IL-8表达量升高（P <0.01）。IL-1β表达量在各组间无明显变化。治疗实验：与模型组相比，洁泽1号治疗组IL-8表达无明显变化，而小檗碱组IL-8表达降低（P <0.05）。IL-1β表达量在各组间无明显变化。 结论： 洁泽1号预防感染时，能显著抑制细胞HBD-2mRNA的表达，此可能是限制局部炎症反应机制之一；而对于已感染白色念珠菌的细胞，洁泽1号能在感染早期促进细胞表达HBD-2mRNA，可对白色念珠菌起到一定的杀伤作用。 人阴道上皮细胞VK2能自主分泌IL-8及少量IL-1β，白色念珠菌热灭活孢子与细胞共孵育后，能降低细胞分泌IL-8的能力，可能是其致病原因之一，对IL-1β分泌无影响。而洁泽1号不会引起VK2细胞分泌IL-8能力的改变。预防性使用洁泽1号或小檗碱，能使细胞感染白色念珠菌时分泌IL-8的能力增强。而洁泽1号对VK2细胞分泌IL-1β无影响。