黄芩汤是《伤寒论》著名方剂,由黄芩、白芍、炙甘草和大枣配伍而成,为清热止利、和中止痛常用之方。目前临床上广泛用于溃疡性结肠炎、急性胃肠炎、细菌性痢疾等胃肠道疾病的治疗。现代药理研究表明黄芩汤具有明显的抗炎、解热和镇痛作用,但黄芩汤的抗炎作用机制至今还不十分明确。目前,黄芩汤的抗炎药理作用研究多局限在宏观层面上,对于分子生物学等深层次的机理研究较少。
本论文以中医药理论为指导,运用现代科技技术,从整体动物、细胞分子不同层面,采用大鼠溃疡性结肠炎模型和体外巨噬细胞炎症模型,对黄芩汤的抗炎药效及作用机制进行了初步探究,为黄芩汤的临床应用和进一步的开发提供科学依据。
研究目的：
1、建立溃疡性结肠炎大鼠模型和巨噬细胞炎症模型,并观察黄芩汤对这两种体内外模型炎症的治疗作用,以明确黄芩汤的抗炎药效。
2、观察黄芩汤对炎症模型中炎症信号通路的影响,以探讨黄芩汤的抗炎作用机制。
研究方法：
1、黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及作用机制探讨
健康雄性SD大鼠,随机分为正常组、模型组、阳性药柳氮磺胺吡啶组、黄芩汤高、中、低剂量组。除正常组外,其余各组运用复合法(三硝基苯磺酸+乙醇)制备细胞免疫反应性溃疡性结肠炎大鼠模型,观察大鼠症候学、结肠病理学改变,判定造模是否成功。造模3天后开始给药,黄芩汤高、中、低剂量组分别按20g/kg、10g/kg、5g/kg灌胃给药,阳性药组按0.5g/kg SASP混悬液给药,正常组和模型组给予等剂量的生理盐水,每日一次。治疗5d后所有大鼠眼眶取血、剖腹取结肠,采用Griess法测定血清中NO含量,ELISA法测定血清IL-6、TNF-α、PGE2含量,运用免疫组化法检测结肠组织中NF-κB p65表达情况。同时,评估各组大鼠饮食量、体重变化情况。
2、黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的抗炎作用及作用机制探讨
2.1黄芩汤对RAW264.7巨噬细胞增殖的影响
RAW264.7细胞使用高糖DMEM培养基,加入10%胎牛血清及终浓度为100U/mL的青霉素和100μg/mL的链霉素,置于37℃,5%CO2环境的培养箱内培养。取对数生长期的细胞,接种于96孔培养板中(1×105个/mL),每孔200μL。采用噻唑蓝(MTT)比色法,检测不同浓度的黄芩汤对RAW264.7细胞活性的影响。
2.2黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞产生的NO浓度的影响
取对数生长期细胞,接种于24孔培养板中(5×105个/mL),每孔0.5mL。实验组用不同浓度的黄芩汤作用6h,去除上清液,加入LPS；模型组不用黄芩汤处理,只加相同剂量的LPS进行刺激；正常组常规培养,不添加黄芩汤及LPS。在培养箱里培养18h,收集细胞上清液,用硝酸还原酶法测定RAW264.7细胞产生的NO含量。
2.3黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞产生的IL-6、TNF-α、PGE2浓度的影响
取对数生长期细胞,接种于24孔培养板中(5×105个/mL),每孔0.5mL。实验组细胞用不同浓度的黄芩汤干预6h,去除上清液,加入LPS刺激；模型组不用黄芩汤处理,加入相同剂量的LPS进行刺激；正常组细胞常规培养,不添加黄芩汤及LPS。在培养箱里培养18h,收集细胞上清液,用酶联免疫法测定黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7细胞产生的IL-6、TNF-α、PGE2浓度的影响。
2.4黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞NF-κB p65mRNA表达的影响
取对数生长期细胞,接种于6孔培养板中(1×106个/mL),每孔2mL。实验组细胞用不同浓度的黄芩汤干预6h,NF-κB抑制剂(PDTC)干预2h,去除上清液,加入LPS刺激；模型组不用黄芩汤处理,加入相同剂量的LPS进行刺激；正常组细胞常规培养,不添加黄芩汤及LPS。在培养箱里培养1h,收集细胞。使用Trizol试剂提取RNA,利用RT-PCR技术检测NF-κB p65mRNA表达。
2.5黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞NF-κB p65蛋白表达的影响
取对数生长期细胞,接种于培养皿中培养,细胞长至70%-80%时,用不同浓度的黄芩汤干预6h,NF-κB抑制剂(PDTC)干预2h,去除上清液,加入LPS刺激；模型组不用黄芩汤处理,加入相同剂量的LPS进行刺激；正常组细胞常规培养,不添加黄芩汤及LPS。在培养箱里培养1h,用细胞裂解液提取总蛋白,并用试剂盒提取细胞核蛋白和细胞浆蛋白,利用Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达情况。
2.6黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞中MAPK炎症信号通路的影响
正常组、模型组及黄芩汤组和上述处理情况一样,抑制剂组分别加入p38、ERK、JNK通路抑制剂干预细胞。LPS刺激1h后提取RNA,利用RT-PCR技术检测ERK mRNA表达情况；LPS刺激30min后提取RNA,利用RT-PCR技术检测p38、JNK mRNA表达情况。LPS刺激1h后,提取总蛋白,利用Western blot法检测p38、ERK、JNK蛋白表达情况。
2.7黄芩汤对LPS诱导的小鼠RAW264.7炎症细胞中JAK-STAT炎症信号通路的影响
正常组、模型组及黄芩汤组和上述处理情况一样,抑制剂组加入JAK-STAT通路抑制剂干预细胞。LPS刺激6h后提取RNA,利用RT-PCR技术检测JAK mRNA表达情况。LPS刺激6h后,提取总蛋白,利用Western blot法检测JAK蛋白表达情况。
2.8LPS诱导的RAW264.7炎症细胞中MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路对NF-κB信号通路的影响
抑制剂组分别加入p38、ERK、JNK和JAK通路抑制剂干预细胞。LPS刺激1h后提取RNA及总蛋白,利用RT-PCR技术检测NF-κB p65mRNA表达,利用Western blot法检测NF-κB p65蛋白表达情况,以探索炎症状态下MAPK信号通路和JAK-STAT信号通路对NF-κB信号通路的影响。
研究结果：
1、黄芩汤对溃疡性结肠炎大鼠的治疗作用及作用机制探讨
造模后,大鼠出现血便、稀便、懒动、竖毛、毛泽无光、体重下降等症状,结肠组织出现明显溃疡,提示造模成功。经药物干预后,各给药组大鼠的症候学和病理学有不同程度的改善。黄芩汤高、中剂量组大鼠饮食量和体重经治疗后显著好转,血清中NO、IL-6、TNF-α、PGE2水平,结肠组织NF-κB p65表达量及组织损伤程度均较模型组显著减轻。模型组大鼠上述指标与正常组相比有显著性差异。
2、黄芩汤对LPS诱导的RAW264.7炎症细胞的抗炎作用及作用机制探讨
2.1与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,释放的炎症介质NOΟ、IL-6、TNF-αPGE2含量显著升高,提示造模成功。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,对炎症细胞释放的NO、IL-6、TNF-α和PGE2都有不同程度抑制的作用。
2.2与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,炎症细胞内NF-κB p65基因及蛋白表达显著升高,且细胞核内的蛋白比细胞浆的表达高。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,炎症细胞内NF-κB p65基因及蛋白表达显著下降,高剂量黄芩汤组细胞核内NF-κB p65蛋白表达比细胞浆低,说明黄芩汤对炎症细胞内NF-κB p65表达有抑制作用,并可抑制NF-κB p65由胞浆向胞核转移。
2.3与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,炎症细胞内p38、ERK和JNK基因及蛋白表达显著升高。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,炎症细胞内p38、ERK和JNK基因及蛋白表达显著下降,说明黄芩汤对炎症细胞内p38、ERK和JNK的表达均有抑制作用。
2.4与正常组相比,LPS刺激RAW264.7巨噬细胞后,炎症细胞内JAK基因及蛋白表达显著升高。不同浓度的黄芩汤孵育细胞后,炎症细胞内JAK基因及蛋白表达显著下降,说明黄芩汤对炎症细胞内JAK的表达有抑制作用。
2.5与模型组相比,p38通路抑制剂组细胞内NF-κB p65基因及蛋白表达均显著下降,ERK、JNK通路抑制剂组细胞内NF-κB p65蛋白表达量与模型组相比显著降低,JAK-STAT通路抑制剂组NF-κB p65基因表达有降低的趋势。说明炎症状态下,p38信号通路可显著调节NF-κB p65的表达,ERK、JNK和JAK-STAT通路对NF-κB通路的影响较小。
研究结论：
1、黄芩汤可通过减少NO、IL-6、TNF-α和PGE2炎症介质的释放来发挥抗炎作用。
2、黄芩汤可通过抑制NF-κB的活化来发挥抗炎作用,进而下调炎症介质NO、IL-6、 TNF-α和PGE2的表达。
3、黄芩汤可通过抑制MAPK和JAK-STAT信号通路活化来发挥抗炎作用。
4、MAPK信号通路中的p38通路对NF-κB通路有较强的调节作用,ERK、JNK和JAK-STAT通路对NF-κB通路也有调节作用,但是效果没有p38通路明显。
